Bases moleculares de la señalización mediada por dUTPasas triméricas de bacteriófagos

Tesis doctoral, 328 p. Figuras y tablas.[EN] Stl is a master repressor encoded by Staphylococcus aureus pathogenicity islands (SaPIs) that participates in the dissemination of these mobile genetic elements on the bacterial chromosome. After infection or induction of a resident helper phage, the SaPIs are de-repressed by specific interactions of the phage proteins with the Stl repressor, allowing the island to replicate and introduce its genetic material into the phage capsids, taking advantage of its machinery to achieve a horizontal gene transfer when virus particles with genetic material from the island infect other cells. SaPIs have developed a fascinating mechanism to ensure their promiscuous transfer by targeting structurally unrelated proteins that perform identical and conserved functions for the phage, the dimeric and trimeric dUTPases. These proteins would act in a similar way to the proto-oncogenic G proteins, where their moonligthing and signaling function would be regulated by dUTP, which would act as a second messenger, allowing or preventing the binding of the repressor and, therefore, the replication and transfer of the genes of the island. In this thesis we decipher the molecular mechanism of this elegant strategy through mutational assays that, firstly, delimit the areas involved in the interaction and, finally, determining and validating the structure of the Stl repressor of SaPIbov1 alone and in complex with dUTPases from different S. aureus phages. Surprisingly, SaPIbov1 Stl is a modular protein capable of interacting with dimeric and trimeric dUTPases through different domains and mechanisms. In case of the SaPIbov1 Stl complex with trimeric dUTPases, the intermediate domain of the repressor plays a key role through the active center of the enzyme emulating its substrate, dUTP, and interacting with conserved motifs of the same. On the other hand, the formation of the repressor complex with dimeric dUTPases is generated through the Cterminal motif, which not only interacts with the active center of the enzyme but also emulates the dimerization surface of the dUTPase, forming a heterodimer. The adquisition of multispecificity through the recruitment of domains proposes Stl from SaPIbov1 as a new type of repressor, which preserves its mechanism of interaction with DNA but allows an evolution of other parts of the protein with the aim of a wide diffusion of the SaPI proteins.[ES] Stl es un represor maestro codificado por islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus (SaPIs) que participa en la diseminación de estos elementos genéticos móviles en el cromosoma bacteriano. Después de la infección o inducción de un fago colaborador residente, las SaPIs son de-reprimidas por interacciones específicas de las proteínas del fago con el represor Stl, permitiendo a la isla replicarse e introducir su material genético en las cápsides del fago, aprovechando su maquinaria para conseguir una transferencia horizontal de genes cuando las partículas víricas con el material genético de la isla infectan otras células. Las SaPIs han desarrollado un mecanismo fascinante para asegurar su transferencia promiscua al dirigirse a proteínas estructuralmente no relacionadas que realizan funciones idénticas y conservadas para el fago, las dUTPasas diméricas y triméricas. Estas proteínas actuarían de manera análoga a las proteínas G protooncogénicas, donde su función moonligthing y señalizadora estaría regulada por dUTP, el cual actuaría de segundo mensajero permitiendo o impidiendo la unión del represor y, por tanto, la replicación y transferencia de los genes de la isla. En esta tesis desciframos el mecanismo molecular de esta elegante estrategia mediante ensayos mutacionales que, primeramente, delimitan las áreas implicadas en la interacción y, finalmente, determinando y validando la estructura del represor Stl de SaPIbov1 solo y en complejo con dUTPasas de diferentes fagos de S. aureus.Sorprendentemente, Stl de SaPIbov1 se trata de una proteína modular capaz de interaccionar con dUTPasas diméricas y triméricas mediante dominios y mecanismos diferentes, En el caso del complejo de Stl de SaPIbov1 con dUTPasas triméricas, el dominio intermedio del represor interviene de manera clave a través del centro activo de la enzima emulando al sustrato de ésta, el dUTP, e interaccionando con motivos conservados de la misma. Por otra parte, la formación del complejo del represor con dUTPasas diméricas se genera a través del motivo Cterminal, el cual no sólo interacciona con el centro activo de la enzima sino que, además, emula la superficie de dimerización de la dUTPasa, formando un heterodímero con ésta. La adquisición de multiespecificidad a través del reclutamiento de dominios propone a Stl de SaPIbov1 como un nuevo tipo de represor, el cual conserva su mecanismo de interacción con ADN pero permite una evolución de otras partes de la proteína con el fin de una difusión amplia de las SaPIs por la naturalezaPeer reviewe