Clonaje, secuenciación y localización intracelular de la isoenzima BB de la fosfoglicerato mutasa de rata

[spa] El trabajo realizado ha consistido en el clonaje y la secuenciación del CDNA de la forma B de la fosfoglicerato mutasa de rata (PGM) por una parte y en el estudio de la localización intracelular de las isoenzimas de la PGM en distintos tejidos de rata por otro. Para llevar a cabo el clonaje, ha sido purificada a homogeneidad la proteína a partir de cerebro de rata, utilizando técnicas cromatográficas y obtenida pura a homogeneidad. Se han preparado los anticuerpos policlonales correspondientes en conejo. Estos anticuerpos muestran total especificidad, reconociendo una única banda por Western-Blot que corresponde al peso molecular de la subunidad de la enzima. Además, dan reacción cruzada con la otra isoenzima la forma M muscular. Los anticuerpos no se han empleado para el clonaje, pero si para los experimentos de localización intracelular. El clonaje se ha realizado utilizando como sonda el CDNA de la forma M previamente aislado por nuestro grupo. El CDNA consta de 1754 pares de bases, con una zona codificante de 762 bases que codifica para una proteína de 253 aminoácidos 96% homologa con la forma correspondiente humana. La homología a nivel de zona codificante es del 90%. EL CDNA tiene una zona no codificante 3' de 894 pares de bases que muestra una conservación con la forma humana del 64%. A nivel de Northern-Blot, este CDNA únicamente reconoce una banda del mismo peso molecular que el CDNA. Los estudios de localización intracelular se han realizado mediante experimentos de inmunocitoquímica y aislamiento de núcleos puros de distintos órganos. La inmunocitoquímica revela marcaje nuclear y citosólico en todos los órganos analizados: cerebro, hígado, corazón y musculo esquelético. Al aislar núcleos de todos estos órganos, se ha observado presencia de actividad enzimática y reacción antígeno-anticuerpo de la fosfoglicerato mutasa, confirmando los resultados de inmunocitoquímica