CRICON-plasmidisysteemin siirtyminen kliinisiin ESBL-bakteerikantoihin

Bakteerit ovat kehittäneet useita erilaisia mekanismeja, joiden avulla ne voivat suojautua antibiootteja ja muita toksisia yhdisteitä vastaan. Tähän tarkoitukseen toimiva keino on vieraan DNA:n hankinta horisontaalisen geeninsiirron avulla, ja myös antibioottiresistenssigeenit leviävät tehokkaasti esimerkiksi konjugatiivisten plasmidien mukana. ESBL (engl. extended spectrum beta-lactamase) -bakteerit kykenevät tuottamaan betalaktamaasi-entsyymejä, jotka hajottavat useita erilaisia bakteeri-infektioiden hoitoon käytettyjä betalaktaamiantibiootteja, minkä vuoksi ne ovat suuri ongelma terveydenhuollolle. CRICON on kahden plasmidin muodostama, konjugaation avulla liikkuva CRISPR-Cas9 -plasmidisysteemi, joka voidaan ohjelmoida sekvenssispesifisesti katkaisemaan antibioottiresistenssi- kuten ESBL-geenejä. Sen on aiemmin tutkittu poistavan tehokkaasti betalaktamaasigeenejä bakteeripopulaatioista, kun kohteena käytetään, Escherichia coli -laboratoriokantoja. Ei kuitenkaan tiedetä, kuinka hyvin se soveltuu antibioottiresistenssigeenien poistamiseen luonnollisista bakteeri-isolaateista. Tämän tutkimuksen tarkoituksena olikin selvittää, kuinka tehokkaasti CRICON siirtyy E. coli -bakteerista kliinisiin ulostenäytteistä eristettyihin ESBLbakteerikantoihin ja millaiset geneettiset tekijät vastaanottajabakteerissa siihen vaikuttavat. CRICON-systeemin siirtymistä tutkittiin konjugaatiokasvatuksilla, joissa CRICON-transkonjugantit selektoitiin antibioottivalinnan avulla. Lopuksi tutkittiin myös millaiset geneettiset tekijät vastaanottavassa ESBL-bakteerissa mahdollisesti vaikuttavat CRICON-systeemin leviämistehokkuuteen. CRICONsysteemi onnistuttiin siirtämään useaan ESBL-kantaan, joiden joukossa oli usea E. coli -kanta, kaksi Klebsiella pneumoniae -kantaa ja yksi Proteus hauseri -kanta. Tutkimuksen perusteella näytti myös siltä, että usean plasmidin esiintyminen kohdebakteerissa heikensi CRICON-systeemin siirtymistä. Tutkimuksen tuloksia voidaan tulevaisuudessa käyttää CRICON-systeemin kehittämiseen ESBLbakteerien poistamiseksi suolistomikrobiomista.Bacteria have developed multiple different mechanisms to protect themselves against antibiotics and other toxic compounds. A practical way to do that is by acquiring foreign DNA via horizontal gene transfer and antibiotic resistance genes also spread efficiently along with conjugative plasmids. ESBL (extended spectrum beta-lactamase) -bacteria produce beta-lactamases, enzymes that can degrade multiple different beta-lactam antibiotics, and their global prevalence poses a significant concern to health care. CRICON is a CRISPR-Cas9 plasmid system composed of two plasmids that move via conjugation. Its CRISPR-system can be programmed to produce sequence specific DNA nicks to antibiotic resistance genes like ESBL-genes. It has been previously found to eradicate resistance genes efficiently from bacterial populations when using Escherichia coli laboratory strains as a target. However, it is not known whether it is applicable for removing antibiotic resistance genes from natural bacterial isolates. The aim of this study was to study the transfer efficiency of CRICON system from E. coli donor strain to ESBL-recipient strains that were isolated from fecal samples and to examine which genetic traits of the recipient impact on the transfer of the system. Conjugation efficiency of CRICON was examined by conjugation cultivations from which the CRICON transconjugants were selected via antibiotic selection. At the end of the study, we examined which genetic traits, such as conjugative plasmids already present in the recipient ESBL-bacteria, affected the CRICON system dispersal. In this study, CRICON system was successfully transferred to multiple ESBL strains representing species such as E. coli, Klebsiella pneumoniae and Proteus hauseri. The study also indicated that multiple plasmids carried by the recipient strain had a negative effect on the CRICON transfer efficiency. In the future, these results can be utilized for more efficient optimization of CRICON system to eradicate ESBL-producing bacteria from microbial communities such as gut microbiome