Preparation of bio-samples using molecularly imprinted polymers (MIPs): development and evaluation of quantitative performances

The analysis of pharmaceutical substances or endogenous compounds in biological matrices is a difficult task but has become essential in many areas in recent years. Indeed, from research and development to marketing, and throughout its use as a therapeutic agent, a drug and its major metabolites must be controlled rapidly and reliably. In addition, bioanalysis of endogenous compounds has become an indispensable source of information for the study and understanding of the mechanisms of many pathologies, in order to further improving current treatments or developing new ones. In bioanalysis, one of the most widely used separation techniques is liquid chromatography (LC). However, prior to LC analysis, a biological sample must be treated. Indeed, in many cases it is necessary to prepare the sample by removing the analytes from the matrix. Moreover, it could also be interesting to concentrate the sample. Among the selective treatments of biological samples, solid phase extraction (SPE) is one of the widely used method in bioanalytical laboratories today. Indeed, SPE and its numerous developments meet analysts' expectations perfectly. Such extractions are easily automated, miniaturizable and therefore compatible with the processing of complex samples at high throughput without becoming a bottleneck in the analytical process. As part of this work, we have focused on the evaluation of molecularly imprinted polymers (MIPs) as SPE sorbents for biological sample preparation. The interest of MIPs lies in their capacity to allow the selective extraction of a compound or a class of compounds in relation with the target molecule used during their synthesis. This high selectivity results from specific interactions between the analytes and the molecular recognition sites of these supports. We have developed and evaluated several molecularly imprinted polymers for solid phase extraction by wisely combining a conventional and a design-based chemometric approach. The choice of one or the other approach was made based on our a priori knowledge and the difficulties encountered during the development of different SPE-LC methods. Consequently, we have developed an innovative methodology for the evaluation of MIPs in the context of bioanalysis. In this strategy, a pragmatic pre-validation step, prior to the physical characterization of the MIP, was implemented in order to quickly obtain information on the analytical performance of the developed method. This strategy allows us to screen MIPs more quickly and efficiently in order to select only those with promising performance. During this work, we were able to apply the experimental design strategy to qualitative factors in an original way. Indeed, the modelling was carried out, for a factor, on the properties of the levels of this factor and not on the levels themselves. The results obtained with this study were informative, but this approach allowed us to demonstrate that it could be adequate for other developments. Our works lead us to the limit of the pragmatic and efficient use of molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) for bioanalysis. Indeed, MIPs are extremely interesting supports regarding to the selectivity they offer, but their development can be long and tedious. Their use should therefore be reserved for special cases where the benefit of selective extraction obtained by this molecular recognition is expected. Specifically, when the compound of interest is a polar molecule with several ionizable functions, the development and evaluation of MISPE may be time-consuming and not efficient. It is therefore essential to properly assess the potential benefit of such development. In such circumstances, it may be more appropriate to develop a method using conventional sorbent for the SPE where possible. It was the case for one of the studied compounds. Therefore, an original method combining classical solid phase extraction with hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to UV detection (SPE-HILIC-UV) for plasma assay was developed resulting to first-class analytical performances. This method has been fully validated according to the total error approach prior to its routine use in a clinical study. In addition, during its routine use, its quantitative performances were subjected to a detailed analysis through the evaluation of the uncertainty associated to generated results.L'analyse de substances pharmaceutiques ou de composés endogènes dans les matrices biologiques est une tâche difficile mais devenue essentielle dans de nombreux domaines ces dernières années. En effet, de sa recherche et développement à sa commercialisation, et durant toute sa vie d'agent thérapeutique, un médicament et ses principaux métabolites doivent pouvoir être dosés de manière rapide et fiable. De plus, la bioanalyse de composés endogènes est devenue une source d'informations indispensable pour l'étude et la compréhension des mécanismes de nombreuses pathologies, et ce afin d’améliorer encore les traitements actuels ou d’en mettre au point de nouveaux. En bioanalyse, une des techniques séparatives les plus utilisées est la chromatographie liquide (LC). Toutefois, avant son analyse en LC, un échantillon biologique doit subir un traitement afin de la rendre compatible avec cette analyse en isolant les analytes de la matrice, mais également, dans certain cas, en enrichissant l’échantillon en ces analytes. Parmi les traitements sélectifs des échantillons biologiques, l’extraction en phase solide (SPE) continue à se développer et est toujours actuellement très répandue dans les laboratoires de bioanalyse. En effet, la SPE et ses nombreuses évolutions répondent parfaitement aux attentes des analystes car elles sont facilement automatisables, miniaturisables et donc compatibles avec le traitement d’échantillons complexes à haute cadence sans en devenir le goulot d’étranglement du processus analytique. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés à l’évaluation de polymères à empreintes moléculaires (MIPs) en tant que supports SPE pour la préparation d’échantillons biologiques. L’intérêt des MIPs réside dans leur capacité à permettre l’extraction sélectivement d’un composé ou d’une classe de composés en fonction de la molécule cible utilisée lors de leur synthèse. Cette sélectivité importante résulte d’interactions spécifiques entre les analytes et les sites de reconnaissance moléculaire de ces supports. Nous avons eu l’occasion de développer et d’évaluer plusieurs polymères à empreintes moléculaires pour l’extraction sur phase solide en combinant efficacement une approche conventionnelle et une approche chimiométrique basée sur les plans d’expériences. Le choix de l’une ou l’autre approche s’est effectué sur la base de nos connaissances a priori et des obstacles rencontrés lors du développement des différentes méthodes SPE-LC. Nous avons ainsi développé une méthodologie novatrice particulièrement intéressante pour l’évaluation de MIPs destinés à la bioanalyse. Dans cette stratégie, une étape de prévalidation pragmatique, avant la caractérisation physique du MIP, a été mise en œuvre de manière à obtenir rapidement des informations quant aux performances analytiques de la méthode développée. Cette stratégie nous permet de cribler plus rapidement et plus efficacement les MIPs afin de ne sélectionner que ceux dont les performances sont prometteuses. Durant ces travaux, nous avons pu appliquer la stratégie de la planification expérimentale à des facteurs qualitatifs de manière originale. En effet, la modélisation était effectuée, pour un facteur, sur les propriétés des niveaux de ce facteur et non sur les niveaux eux-mêmes. Les résultats obtenus avec ce plan ont été informatifs, mais cette approche nous a permis de démontrer qu’elle pouvait s’avérer adéquate pour d’autres développements. Nos travaux nous ont emmenés à la limite de l’utilisation pragmatique et efficace de l’extraction sur phase solide à empreintes moléculaires (MISPE) pour la bionalyse. En effet, les MIPs sont des supports extrêmement intéressants du fait de la sélectivité qu’ils offrent, mais leur développement peut s’avérer long et fastidieux. Il convient dès lors de réserver leur utilisation à des cas particuliers où le bénéfice d’une extraction sélective obtenue par cette reconnaissance moléculaire est attendu. Plus précisément, lorsque le composé d’intérêt est une molécule polaire avec plusieurs fonctions ionisables, le développement et l’évaluation de MISPE peuvent s’avérer chronophages et peu efficients. Il donc essentiel de bien évaluer le bénéfice potentiel d’un tel développement. Dans ces circonstances, il est parfois plus judicieux de développer une méthode utilisant des supports classiques pour la SPE lorsque cela est possible. Pour un des composés étudiés, ce fut l’option retenue. Une méthode originale combinant l’extraction sur phase solide classique à la chromatographie liquide à interaction hydrophile couplée à une détection UV (SPE-HILIC-UV), pour un dosage plasmatique, a donc été développée et a montré des performances analytiques de premier ordre. Cette méthode a été entièrement validée selon l'approche de l'erreur totale avant d’être utilisée en routine dans le cadre d’une étude clinique. De plus, au cours de son utilisation en routine, ses performances quantitatives ont fait l’objet d’une analyse fine à travers l’évaluation de l’incertitude associée aux résultats générés