Obtenção de plantas de arroz com níveis alterados de ferro nos grãos através de edição genômica

Segundo a OMS, a deficiência de ferro é a causa mais comum de anemia no mundo, acometendo cerca de 1,62 bilhões de pessoas. No Brasil, aproximadamente 3 milhões de crianças menores de 5 anos apresentavam anemia em 2006. O RS é o maior produtor de arroz do país e possui caracteristicamente solos ácidos ricos em ferro. O pH baixo aumenta disponibilidade do ferro para as raízes e leva inclusive a sintomas de toxicidade nas plantas de arroz. Mesmo com a alta disponibilidade de ferro para as plantas, os grãos de arroz acumulam muito pouco deste mineral. Desta forma, é essencial elucidar os mecanismos que levam ao aporte de ferro para as sementes com vistas de viabilizar a biofortificação do arroz. Os genes OsVIT1 e OsVIT2 são altamente expressos em folhas bandeira e regulam o transporte de Fe e Zn através do tonoplasto até os vacúolos. Mutantes perda-de-função para cada um dos genes apresentaram acúmulo de Fe e Zn em sementes, tornando-os bons alvos para edição genética visando a biofortificação de arroz. Diante disso, o objetivo do presente trabalho é gerar um mutante duplo, perda-de-função simultânea para os genes OsVIT1 e OsVIT2, utilizando a tecnologia de edição gênica mediada por CRISPR/Cas9. Para isso, foi construído um vetor contendo os cassetes para a expressão em células vegetais da enzima Cas9 e o sgRNA que guia o corte da enzima no genoma da planta. A seleção da sequência alvo do RNA guia foi baseada em um alinhamento dos genes OsVIT1 e OsVIT2 buscando-se uma região exclusiva e compartilhada entre os dois genes dentre todo o genoma do arroz. Desta forma foi sintetizado apenas um RNA guia para a edição de ambos genes, que foi inserido no plasmídeo binário, originando o vetor pH7Cas9U3pgVIT. Calos de arroz foram transformados utilizando Agrobacterium tumefaciens e foram obtidas 10 linhagens transgênicas, que se encontram em processo de regeneração e aclimatação. As plantas obtidas serão avaliadas quanto à presença das mutações nos loci de OsVIT1 e OsVIT2 e, se confirmadas, possibilitarão estudos pioneiros sobre os efeitos da perda de função simultânea destes genes na alocação de ferro para as sementes.According to WHO, the iron deficiency is the most common cause of anemia worldwide, affecting approximately 1,62 billion people. In Brazil, almost 3 million children younger than 5 years old presented anemia in 2006. The state of Rio Grande do Sul is the major producer of rice in the country and have characteristically acid iron-rich soils. The low pH enhances the iron availability to the roots and can lead to toxicity symptoms in rice plants. Even with the high iron availability to the plants, rice seeds accumulate low amounts of this mineral. Thus, it is essential to elucidate the mechanisms that lead to iron transport to seeds in order to allow rice biofortification. The OsVIT1 and OsVIT2 genes are highly expressed in flag leaves and regulate the transport of iron and zinc through the tonoplast to the vacuole. Loss-of-function mutants for each gene presented higher accumulation of iron and zinc on the seed, making them good targets for the genetic editing towards rice biofortification. Therefore, the goal of the present work is to generate a double loss-of-function mutant for the OsVIT1 and OsVIT2 genes using the genome editing technology mediated by CRISPR/Cas9 system. For that matter, a vector was constructed containing the cassettes for the Cas9 expression on plant cells and a single guide RNA (sgRNA), which guides the enzyme cut in the plant genome. The selection of the sgRNA was based on an alignment of the OsVIT1 and OsVIT2 genes, searching for an exclusive and shared region between them in the rice genome. This sgRNA, that can edit both genes, was inserted in a Cas9 binary plasmid, originating the pH7Cas9U3pgVIT vector. Rice calli were transformed with Agrobacterium tumefaciens and 10 transgenic lineages were obtained. The regenerated plants will be evaluated for the presence of the mutations on the OsVIT1 and OsVIT2 loci and, if confirmed, will enable pioneer studies of the effects of the simultaneous loss of those genes in the allocation of iron to the seeds