Salmonella em uma cadeia de produção de carne suína brasileira: ocorrência, diversidade, genótipos de virulência e perfil de resistência antimicrobiana

Salmonella spp. is considered one of the main foodborne pathogens associated to food poisoning outbreaks worldwide. Salmonella strains have been detected in several countries. The aim of this study was to track Salmonella spp. contamination in pork production chain during slauthering and processing. Also, the aim was to provide a deep characterization of the isolates by molecular analysis. The collections were carried out in ten different farms, which were selected based on the existence of an intensive breeding system with a similar number of pigs in all the farms (average 1000), and the same company provided the piglets and feed. All selected pig farms sent stock to the same slaughterhouse. At pig farms, the following samples were collected: feed from the top of feeder pigs (n=10), water from the bite drinkers (n = 10), barn floor (n = 100). After transport, pigs were sampled at the slaughterhouse including the lairage floor (n=10, as sampled in barn floors), swine carcasses (10 carcasses per lot, n = 100), blood samples (n = 100), processing environment (n = 120), and pork cuts (n = 40). Also, portions of diaphragm (n = 100), palatine tonsils (n = 100) and mesenteric lymph nodes (n=100) were sampled from each pig carcass after evisceration. Blood and meat juice were subjected to ELISA to detect antibodies against Salmonella, and other samples were subjected to Salmonella detection by ISO 6579. After confirmation the isolates were subjected to serogrouping, macro- restriction digests and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), detection of virulence-related genes and antimicrobial-resistance phenotyping. Also, 41 isolates were selected to whole- genome sequencing. Salmonella was recovered from barn floors from 3 pig farms (3/10), lairage floors (7/10), carcasses after bleeding (2/100) and final washing (1/100), palatine tonsils (45/100), mesenteric lymph nodes, (43/100), utensils (3/120) and cuts (4/40). The most prevalent serogroup was O: 4 (82%) followed by O:3 (7.7%); O:9 (5.1%); O:8 (2.6%) and O:7 (2.6%). Based on ELISA, Salmonella positive samples were: 86 and 46 blood serum (20% and 40% cut-offs) and 68 and 46 meat juice (20% and 40% cutoffs). Optical density readings from blood serum and meat juice presented a high and significant correlation (r = 0.93, p < 0.001). Recovered strains (n = 109) were classified into 24 different pulsotypes (XbaI restriction digest), which were arranged into five different clusters. Fourteen different virulence genotypes were observed based on 15 loci, and all isolates were positive for invA, sitC, pagC and tolC. Whole-genome sequencing and in silico serotyping demonstrated that the S. enterica serovar Typhimurium was the most common serotype (n = 17), but eight additional servoars were identified. Eight multilocus sequence types were identified with ST19 being most common (n = 21). Several plasmids replicons were detected, with Col (RNAI) the most abundant (n = 30), followed by IncR (n = 22), IncI1 (n = 10) and IncA/C2 (n = 10). High rates os resistance were observed, mainly to streptomycin, tetracycline, ampicillin, chloramphenicol and ciprofloxacin. Only two isolates were resistant to third-generation cephalosporins and no isolates were resistant to two tested carbapenems. Twenty-six unique antimicrobial-resistance genes were identified with bla TEM-1A and bla TEM-1B likely responsible for most beta-lactam resistance and floR responsible for most chloramphenicol resistance. At the time of collection, the sampled farms were adding ciprofloxacin to feed, and this may have contributed to the high prevalence of resistance to this antibiotic. A majority of isolates were considered multidrug resistant (resistant to 3 or more antibiotic classes). This study provides valuable insight about the epidemiology of Salmonella in swine production. Despite the low presence of this pathogen in carcasses and meat cuts, the presence of the pathogen in lymph nodes and tonsils emphasizes the importance of slaughterhouse hygiene measures. Considering the antimicrobial resistance global scenario, the high occurrence of multidrug resistant isolates from pork production is a serious data. The antibiotic use must be controlled, and it is recommended that antibiotics considered to be of critical importance to human health should be avoided in animal use. Keywords: Ciprofloxacin. ELISA. MLST. Swine. WGS.Salmonella spp. é mundialmente considerada um dos principais patógenos associados com surtos de origem alimentar. Estirpes de Salmonella multirresistentes aos antibióticos tem sido detectadas em diversos países do mundo. O objetivo desse trabalho foi rastrear a contaminação de Salmonella spp. na cadeia de produção de suínos durante o abate e processamento além de realizar a caracterização molecular dos isolados. As coletas foram realizadas em dez diferentes granjas de suínos de sistema intensivo com média de 1000 suínos/granja. Todos as granjas abatiam os animais em um mesmo matadouro-frigorífico. Nas granjas as amostras coletadas foram: ração (n=10), água (n = 10) e swab do piso (n = 10). Posteriormente, no local do abate, as seguintes amostras foram coletadas: piso da pocilga de espera (n = 10), carcaça de suínos (n = 100), swabs de produto final (n = 40), amostras de sangue (n = 100), amostras do diafragma (n = 100), tonsilas palatinas (n = 100), linfonodos mesentéricos (n = 100) e amostras do ambiente de processamento (n = 120). Sangue e suco da carne (proveniente do pilar do diafragma) foram submetidos ao teste de ELISA e as demais amostras a detecção microbiológica de Salmonella de acordo com a ISO 6579. Nos isolados confirmados foram realizadas as analíses de soroagrupamento, PFGE e pesquisa de genes de virulência e resistência antimicrobiana. Além disso, foram selecionados 41 isolados para sequenciamento completo do genoma. Salmonella spp. foi detectada em pisos de granjas (03/10), pocilgas de espera (07/10), carcaça após a sangria (2/100) carcaça após a lavagem final (1/100), tonsilas (45/100), linfonodos mesentericos (43/100), utensílios (3/120) e cortes (4/40). Os isolados encontrados nas amostras pertenciam aos sorogrupos: O:4 (82%), O:3 (7,7%), O:9 (5,1%), O:8 (2,6%) and O:7 (2,6%). Baseado no teste de ELISA, 86 e 46 amostras do plasma sanguíneo foram positivas (ponto de corte 20% e 40%), enquanto 68 e 46 amostras de suco da carne foram positivas (ponto de corte 20% e 40%). Foi verificado uma alta correlação (r = 0.93, p < 0.05), entre as leituras da densidade ótica do soro e do suco de carne. Baseado na análise de PFGE, 109 cepas foram alocadas em 24 diferentes padrões de pusotipos, arranjados em cinco diferentes clusters. Catorze diferentes perfis de virulência foram observados de acordo com a combinação dos genes detectados e todos os isolados foram positivos para o gene invA, sitC, pagC e tolC. Com base na análise do genoma, a sorotipificação in silico identificou nove diferentes sorovares, sendo que Salmonella enterica sorovar Typhimurium foi o mais comum (n = 17). A análise do MLST revelou oito ST diferentes, em que O ST-19 foi o mais comum (n = 21). Detectou-se múltiplos replicons de plasmídeos, sendo que os mais abundantes foram Col (RNAI) (n = 30), IncR (n = 22), IncI1 (n = 10) e IncA/C2 (n = 10). Altas taxas de resistência antimicrobiana foram observadas no estudo, principalmente frente aos seguintes antimibrocianos: estreptomicina, tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol e ciprofloxacina. Apenas dois isolados foram resistentes a cefalosoprinas de terceira geração e nenhum isolado foi resistente aos carbapenens testados. Vinte e seis genes de resistência foram identificados, sendo bla TEM-1A e bla TEM-1B os maiores responsáveis pela resistência aos beta-lactâmicos e floR o gene responsável pela maioria das resistências ao cloranfenicol. Durante o período em que as coletas foram realizadas, a adição de ciprofloxacina de maneira preventiva era feita via ração, fato que pode ter contribuído para a alta prevalência de resistência a este antibiótico. A maioria dos isolados avaliados foram considerados multirresistentes (resistentes a 3 ou mais classes de antibióticos). Este estudo elucidou pontos importantes da epidemiologia de Salmonella na cadeia de produção de carne suína. Apesar da baixa ocorrência do patógeno em carcaça e cortes finais, a presença do mesmo em linfonodos e tonsilas deixa claro a importância da adoção de medidas de higiene pelo abatedouro. Considerando o cenário mundial de resistência a antibióticos, a alta ocorrência de isolados multirresistentes provenientes da produção de suínos é um dado de extrema importância, visto que o uso de antibióticos deve ser controlado e é recomendado que os antibióticos considerados de importância crítica à saúde humana sejam evitados em uso animal. Palavras-chave: Ciprofloxacina. ELISA. MLST. Suínos. WGS.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic