Caracterização de sistemas de bombas de efluxo de Aliarcobacter butzleri

Aliarcobacter butzleri é um enteropatogéneo emergente reconhecido como a quarta espécie mais comum em amostras diarreicas entre os Campylobacter-like organisms, encontrando-se na lista de microrganismos considerados um perigo grave para a saúde humana, pela Comissão Internacional em Especificações Microbiológicas para Alimentos. Este organismo patogénico é conhecido por apresentar múltipla resistência a antibióticos, podendo assim originar um problema no tratamento de infeções causadas por esta bactéria. Informação prévia acerca desta bactéria sugere que a mesma contém diversos sistemas putativos de efluxo que permanecem por caracterizar, e que poderão ter um papel relevante como mecanismos de resistência a antimicrobianos. Assim, com este trabalho pretendeu-se estudar o papel de cinco sistemas de efluxo distintos, todos da família "Resistance nodulation cell division". Para tal, o estudo foi iniciado com construção de mutantes de A. butzleri, utilizando uma estirpe naturalmente transformável(AB28/11), através da interrupção dos genes codificantes da proteína de membrana interna responsável pelo reconhecimento do substrato. Dos cinco sistemas em estudo só foi possível gerar mutantes para três, onde se procedeu à interrupção dos genes areB, areE e areG, correspondentes às bombas de efluxo AreABC, AreDEF e AreGHI, respetivamente. A construção dos mutantes foi confirmada pela técnica de “Reverse Transcription-Polimerase Chain Reaction”. Posteriormente, foram realizados uma série de testes para comparação entre os mutantes e a estirpe parental. Quanto ao crescimento bacteriano não foram observadas diferenças significativas entre estirpes. De seguida, foi avaliada a contribuição de cada sistema de efluxo em estudo para a resistência a antibióticos, sais biliares e biocidas, pela determinação da concentração mínima inibitória pelo método de microdiluição. Os resultados mostram que: a inativação do gene areG teve um impacto na resistência a cinco das seis classes de antibióticos testadas, bem como na resistência a diversos biocidas; a inativação do gene areB teve um impacto na resistência às cefalosporinas, estreptomicina, fluoroquinolonas e macrólidos; o perfil fenotípico de resistência do mutante AB28/11?areE foi semelhante à estirpe parental. Para além disso, procedeu-se à avaliação do papel do sistema de efluxo na acumulação intracelular de compostos, usando um método de fluorescência, que avaliou a acumulação de brometo de etídio, nas estirpes parental e mutantes. Esta avaliação demonstrou que a bomba AreABC apresenta um papel importante na extrusão de compostos tóxicos, visto que se observou uma maior acumulação de brometo de etídio do que a observada para a estirpe parental, demonstrando uma menor atividade global dos sistemas de efluxo das células. Em suma, com este trabalho foi possível caraterizar o papel dos sistemas de efluxo AreABC, AreDEF e AreGHI na resistência de A. butzleri, tendo-se destacado o potencial papel dos sistemas AreABC e AreGHI para a multirresistência desta bactéria.Aliarcobacter butzleri is an emerging enteropathogen recognized as the fourth most common species in diarrheal samples among the Campylobacter-like organisms, being on the list of microorganisms considered to be a serious hazard to human health according to the International Commission on Microbiological Specifications for Food. This pathogenic organism is known to be multidrug resistant, which may cause complications in the treatment of infections caused by this bacterium. Previous studies regarding this bacterium suggest that it contains several putative efflux systems that remain to be characterized, and these may have a relevant role as mechanisms of resistance to antimicrobials. This study aimed to evaluate the role of five different efflux systems from the Resistance nodulation cell division pump family. To this end, the study started with the construction of A. butzleri mutants, using a naturally transformable strain (AB28/11), by interrupting the genes coding for the inner membrane protein responsible for substrate recognition. From the five systems under study, it was only possible to generate mutants for thee of them, where the genes areB, areE and areG, from to the AreABC, AreDEF and AreGHI efflux pumps, respectively, were interrupted. The construction of the mutants was confirmed by the technique of reverse transcription-polymerase chain reaction. Subsequently, a series of tests were carried out to compare the mutants and the parental strain. As for bacterial growth, no significant differences were observed among strains. Then, the contribution of each efflux system under study for resistance to antibiotics, bile salts and biocides was evaluated, by determining the minimum inhibitory concentration through the microdilution method. Following this, the results showed that: inactivation of the areG gene had an impact on resistance to five of the six classes of antibiotics tested, as well as on the resistance to several biocides; the inactivation of the areB gene had an impact on resistance to cephalosporins, streptomycin, fluoroquinolones and macrolides; the resistance phenotype of the mutant AB28/11?areE was similar to the one of the parental strain. In addition, the role of the efflux system in the intracellular accumulation of compounds was evaluated using a fluorescence method, which evaluated the accumulation of ethidium bromide, in parental and mutant strains. This assay showed that the pump AreABC provides an important role in the extrusion of toxic compounds, since a higher accumulation than the observed for the parental strain was observed, showing a reduced global activity of the efflux systems. In sum, with this work we were able to characterize the role of the AreABC, AreDEF and AreGHI pumps in the resistance of A. butzleri, focusing on the potential role of the AreABC and AreGHI systems on multidrug resistance of this bacterium