Biosenseurs pour l’étude des dynamiques des conformations et pharmacologie des récepteurs dimériques transmembranaires

Les récepteurs transmembranaires traduisent les informations extracellulaires en signaux intracellulaires sont classés en fonction de leur mécanisme de transmission des signaux à travers la membrane plasmique. Nombre de ces récepteurs sont assemblés en dimères constitutifs ou induits par le ligand. Si les récepteurs liés à une enzyme, tels que le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF), peuvent être des dimères induits par le ligand, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) activés par le neurotransmetteur glutamate sont des dimères constitutifs liés de manière covalente. Il est important de comprendre comment ces récepteurs transmettent le signal pour développer des médicaments les ciblant. Le récepteur de l'EGF est un récepteur à domaine tyrosine kinase (RTK) impliqué dans la différenciation et la prolifération des cellules. Son inhibition par des médicaments est utilisée dans le traitement de cancers, mais les effets secondaires et la résistance aux traitements restent des obstacles majeurs. Sa structure tridimensionnelle complète étant inconnue, son processus d'activation n’est pas complétement compris et résulterait soit d’une dimérisation induite par le ligand soit de changements de conformation au sein de dimères pré-assemblés. Ceci est suivi par la phosphorylation du domaine intracellulaire du récepteur et la génération de cascades de signalisation intracellulaire. En générant un biocapteur conformationnel fluorescent, nous avons démontré que l'activation du récepteur par l’EGF résulte de sa dimérisation induite par le ligand. Nous avons également découvert que certains inhibiteurs non compétitifs du domaine tyrosine kinase (TK) induisent la formation de dimères par un contact des domaines TK, mais sans activer le récepteur. Il est à noter que l'internalisation induite par l’EGF n'est pas bloquée par les inhibiteurs des TKs (ITK), ce qui démontre qu'elle ne nécessite pas l'activité du domaine TK et qu'elle dépend probablement de la conformation du dimère. Ceci est soutenu par l’observation que les ITKs favorisant la formation de dimères ralentissent l'internalisation. Ce résultat montre que le processus d'activation/dimérisation du récepteur de l'EGF peut être modifié par des ITKs et que son internalisation est régulée par sa conformation monomère/dimère plutôt que par sa phosphorylation. Le récepteur métabotropique du glutamate (mGlu) 4 est un dimère constitutif qui joue un rôle important dans la régulation de nombreuses synapses dans le cerveau. Récemment, l'existence d'un hétérodimère mGlu2-mGlu4 a été prouvée dans le cerveau, mais sa fonction reste inconnue en raison du manque d'outils permettant de le contrôler sélectivement. Pour approfondir l'étude des homo- et hétérodimères mGlu4, un nanocorps innovant qui discrimine ces récepteurs a été développé. Ce nanocorps est sélectif pour le récepteur mGlu4 humain et stabilise la conformation active de l'homodimère, ce qui en fait un agoniste complet. En combinant des simulations de dynamique moléculaire et une mutagenèse dirigée, l'épitope et le mécanisme d'action du nanocorps ont été identifiés, révélant une nouvelle façon d'activer les récepteurs mGlu. À l'inverse, ce nanocorps est incapable d'activer les hétérodimères mGlu2-mGlu4, sur lesquels il agit comme un modulateur allostérique positif par une action asymétrique sur l'hétérodimère. Ce nanocorps est le premier outil pharmacologique qui permet de distinguer les homo- et les hétérodimères. Nos études ont révélé l'importance de la conformation des récepteurs dimériques pour contrôler leur signalisation, comme le montrent les ITKs contrôlant la conformation des dimères induits par les domaines TK et le processus d'internalisation du récepteur de l'EGF, ou en montrant que les nanocorps peuvent contrôler spécifiquement un dimère de récepteur composé de sous-unités spécifiques. Ces résultats montrent l'importance de la régulation allostérique et asymétrique des récepteurs transmembranaires dimériques.Transmembrane receptors are proteins that translate extracellular information into intracellular signals. These proteins are categorised based on the way they transduce signals through the plasma membrane. In many cases such transduction involves the formation of dimers, either ligand-induced or constitutive dimers. For example, while the enzyme-linked receptors, such as the Epidermal Growth Factor (EGF) receptor, may be ligand-induced dimers, the G protein-coupled receptors (GPCR) activated by the neurotransmitter glutamate are covalently linked constitutive dimers. Understanding how a signal can be transduced from the extracellular domain into the cell is important to develop novel drugs targeting such receptors.The EGF receptor is a member of the receptor tyrosine kinase (RTK) class and is involved in cell differentiation and proliferation. Inhibition of the EGF receptor by medication is used as a successful treatment for a variety of cancers, but side effects and resistance to medication remain common major obstacles. The full-length EGF receptor crystal structure is unknown, which leaves ambiguity to the precise activation process and the effect of inhibitors. Its activation mechanism has been described as either ligand-induced dimerization or conformational changes within pre-assembled dimers. This is followed by phosphorylation of the intracellular domain of the receptor and the generation of intracellular signalling cascades. By generating a fluorescent conformational biosensor, we showed that the activation of the EGF receptor by its endogenous agonists results from ligand-induced dimerization. We also found that some non-competitive tyrosine kinase (TK) inhibitors also induce dimer formation, without activating the receptor, through a direct contact of the TK domains. Strikingly, internalization induced by its endogenous ligand is not blocked by the non-competitive inhibitors, demonstrating it does not require TK domain activity and is likely mainly dependent on receptor dimer conformation. This is supported by our observation that TK inhibitors promoting dimer formation slowed down the internalization process. This finding shows that the activation/dimerization process of the EGF receptor can be changed by inhibitors and that internalization of the EGF receptor is regulated by monomeric/dimeric conformations rather than by phosphorylation of the receptor.In contrast to the EGF receptor, the metabotropic glutamate (mGlu) 4 receptor is a constitutive dimer that is important for the regulation of many synapses in the brain. Recently, an mGlu2-mGlu4 heterodimer was proven to exist in the brain, but its function remains unknown due to the lack of tools selectively controlling it. To further investigate mGlu4 homo- and heterodimers, an innovative nanobody that discriminates between these receptors was developed. The nanobody is selective for the human mGlu4 receptor, and stabilizes the active homodimer conformation, making it a full agonist. By combining molecular dynamics simulations and site-directed mutagenesis, the epitope and mechanism of action of the nanobody were identified, revealing a new way of activating mGlu receptors. Conversely, this nanobody is incapable of activating heterodimeric mGlu2-mGlu4, where it acts as positive allosteric modulator through asymmetric activation of the heterodimer. This nanobody is the first pharmacological tool that discriminates between homo- and heterodimers.Overall, our studies revealed how important is the conformation of dimeric receptors to control their signalling, as shown with the TK inhibitors controlling to conformation of the TK domain-induced dimers and the internalization process of the EGF receptor, or by showing that nanobodies can control specifically a receptor dimer made of specific subunits. These findings show the importance of allosteric and asymmetric regulation of dimeric transmembrane receptors