Engenharia metabólica de zymomonas mobilis para a produção de ácidos orgânicos a partir de xilose

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.Os ácidos orgânicos apresentam potencial de substituir produtos petroquímicos e oferecem grupamentos funcionais para a sua conversão em materiais de alto valor agregado. Exemplos incluem os ácidos itacônico e xilônico, que foram escolhidos dentre 30 blocos de construção selecionados por um relatório do NREL (National Resource Energy Laboratory), ambos apresentando importantes aplicações na indústria química. Organismos procarióticos já foram modificados para a produção destes dois ácidos orgânicos, demonstrando, assim, o potencial da sua produção por rota biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de linhagens de Zymomonas mobilis capazes de produzir ácido itacônico e xilônico a partir de xilose, cuja utilização é relevante para a valorização da biomassa lignocelulósica. Para a utilização da xilose como fonte de carbono para a produção de ácido itacônico, a integração dos genes de metabolização da xilose xylA, xylB, tktA e talB era necessária, contudo, isto não foi possível. Ainda, a expressão do gene CAD1, codificador da enzima chave na produção de ácido itacônico cis-aconitato descarboxilase, não levou à produção deste ácido por Z. mobilis. Em contrapartida, Z. mobilis foi capaz de produzir ácido xilônico. Primeiramente, foram avaliados sete genes codificadores da enzima XDH (xilose desidrogenase), tendo sido selecionado o gene correspondente de Paraburkholderia xenovorans, o qual levou a uma produtividade volumétrica de 1,85 ± 0,06 g L-1 h -1 , aproximadamente 93% maior do que aquela apresentada quando Z. mobilis expressou o gene de Caulobacter crescentus, o mais utilizado na literatura para a engenharia de linhagens produtoras de ácido xilônico. Após a deleção do gene da xilose redutase, Z. mobilis foi capaz de produzir 56,44 ± 1,93 g L-1 de ácido xilônico a partir de 54,27 ± 0,26 g L-1 de xilose em biorreator, com rendimento de 1,08 ± 0,02 gAX gX-1 , o que representa 97,3% do máximo teórico para este bioprocesso. Esta linhagem também foi avaliada na fermentação de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou na produção de 11,13 g L-1 de ácido xilônico a partir de 10 g L-1 de xilose. Na tentativa de melhorar ainda mais este processo, foi expresso o gene xylE de Escherichia coli, codificador para um transportador de xilose. Contudo, as linhagens expressando este transportador tiveram seu crescimento prejudicado e uma menor produção de ácido xilônico. Os resultados aqui apresentados demostram que Z. mobilis pode ser considerada como uma potencial plataforma de produção de ácidos orgânicos utilizando a biomassa lignocelulósica como fonte de carbono, estando dentro do contexto de biorrefinarias.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Organic acids can replace petrochemical products and provide functional groups that can be used in its conversion into high value materials. Examples include itaconic and xylonic acids, which were chosen as the top 30 high value chemicals by a NREL report and both present important applications in chemical industry. Procaryotic organisms have already been engineered for the production of these two organic acids, thus showing the viability of the biotechnological route for their production. This way, the aim of this work was the development of Zymomonas mobilis strains capable of producing itaconic and xylonic acids from xylose, whose utilization is of utmost importance in lignocellulosic biomass valorization. In order to utilize xylose as carbon source for the production of itaconic acid, it was necessary to integrate the genes from xylose pathway (xylA, xylB, tktA, talB). However, this integration was not possible probably due to the large size of the integration cassettes. The expression of the CAD1 gene, coding for the key enzyme of itaconic acid production cis-aconitate decarboxylase, did not lead to the production of the aforementioned acid in Z. mobilis. In contrast, Z. mobilis was able to produce xylonic acid. Firstly, seven coding genes for the enzyme XDH (xylose dehydrogenase) were evaluated, and the corresponding gene from Paraburkholderia xenovorans was selected. The expression of this gene led to a volumetric productivity of 1.85 ± 0.06 g L-1 h -1 , an increasing of approximately 93% compared to the strain expressing XDH gene from Caulobacter crescentus, the most utilized enzyme for metabolic engineering of microorganisms for xylonic acid production. After the deletion of xylose reductase gene in Z. mobilis, the engineered strain was able to produce 56.44 ± 1.93 g L-1 xylonic acid from 54.27 ± 0.26 g L-1 xylose in bioreactor, reaching a yield of 1.08 ± 0.02 gAX gX -1 , which represents 97,3% of the theoretical maximum for this bioprocess. This strain was also evaluated in the fermentation of sugarcane bagasse hydrolysate, which resulted in the production of 11.13 g L-1 xylonic acid from 10 g L-1 xylose. In the attempt of further increasing the production of xylonic acid in this process, the coding gene for xylose transporter, xylE, from Escherichia coli was expressed in Z. mobilis. However, the strain expressing this transporter had its growth impaired and showed a smaller xylonic acid production compared to the strain without the transporter. The results of this work reveal that Z. mobilis can be regarded as a potential platform for the organic acid production using lignocellulosic biomass as a carbon source in the context of biorefineries