Validação da cepa K2W para produção de 2’-Fucosillactose em Kluyveromyces lactis

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2021.A 2’-fucosil-lactose (2’-FL) corresponde a cerca de 80% dos oligossacarideos presentes do leite materno (OLMs) . É um trissacarídeo neutro composto por unidades de L-fucose, D-galactose e D-glicose que se destaca por sua atividade imunomodulatoria; por atenuar processos inflamatórios ao servir como uma fibra dietética ao diminuir interações entre patógenos com a mucosa gastrointestinal em recém-nascidos. A cepa K2W foi construída utilizando a levedura Kluyveromyces lactis como plataforma biológica, pelo Laboratório de Engenharia de Biocatalisadores (LABIOCAT) da Universidade de Brasília (UnB) para produção de 2’-FL. A cepa é capaz de produzir, em tese, o oligossacarídeo 2’-FL usando como substrato lactose e hidrolisado acido seguido de tratamento enzimático provindo da semente do açaí composto majoritariamente por manose. O vetor de expressão, o plasmídeo integrativo pKLAC2 (NEB) foi usado para a inserção de três genes exógenos que codificam enzimas que viabilizam a produção de 2’-FL: manose 4,6-desidratase (gmd) e GDP-L-fucose-sintase (fcl), clonadas diretamente do genoma de Escherichia coli; e uma fusosiltransferase putativa (wcfB), produzida por síntese gênica e originária do genoma da bactéria Bacterioides fragillis. O plasmídeo final foi chamado de p2WF, contudo, além da presença de sítios de SacII que liberam as regiões de homologia do vetor para a integração ao genoma, revelou-se a existência de um terceiro sítio na região do gene gmd impossibilitando um processo de integração. Assim, o presente estudo descreve estratégias para a integração do plasmídeo p2WF no genoma da levedura K. lactis e o melhoramento do vetor de expressão para o processo de integração. As tentativas de eliminar o sítio de SacII no gene gmd foram realizadas através da técnica de mutagênese sítio-dirigida e técnicas como Montagem Gibson. Os 3 cassetes de expressão foram confirmados na cepa K2W_∆SACII, validando assim a integração genica e confirmando a construção da cepa. Estudos seguem para a detecção do açúcar.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).2’-fucosyl-lactose (2’-FL) corresponds to about 80% of the oligosaccharides present in breast milk (OLMs). It is a neutral trisaccharide composed of L-fucose, D-galactose and D-glucose units that stands out for its immunomodulatory activity; for attenuating inflammatory processes by serving as a dietary fiber by decreasing interactions between pathogens with the gastrointestinal mucosa in newborns. The K2W strain was built using the yeast Kluyveromyces lactis as a biological platform, by the Biocatalyst Engineering Laboratory (LABIOCAT) of the University of Brasília (UnB) for the production of 2’-FL. The strain is capable of producing, in theory, the oligosaccharide 2’-FL using lactose and acid hydrolyzate as substrate, followed by enzymatic treatment from the açaí seed, mainly composed of mannose. The expression vector, the integrative plasmid pKLAC2 (NEB) was used to insert three exogenous genes that encode enzymes that enable the production of 2'-FL: mannose 4,6-dehydratase (gmd) and GDP-L-fucose- synthase (fcl), cloned directly from the genome of Escherichia coli; and a putative fusosyltransferase (wcfB), produced by gene synthesis and originating from the genome of the bacterium Bacterioides fragilis. The final plasmid was called p2WF, however, in addition to the presence of SacII sites that release the homology regions of the vector for integration into the genome, it was revealed the existence of a third site in the region of the gmd gene, making an integration process impossible . Thus, the present study describes strategies for the integration of the p2WF plasmid into the K. lactis yeast genome and the improvement of the expression vector for the integration process. Attempts to eliminate the SacII site in the gmd gene were carried out using the technique of site-directed mutagenesis and techniques such as Gibson Assembly. The 3 expression cassettes were confirmed in the K2W_∆SACII strain, thus validating the genetic integration and confirming the construction of the strain. Studies continue to detect sugar