Identificação e caracterização de componentes genéticos de resistência em Musa acuminata a Pseudocercospora musae

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020.A banana (Musa spp.) é uma das frutas mais importantes do mundo, base da alimentação familiar em diversos países, sendo uma relevante fonte nutricional, rica em carboidratos, fibras, vitaminas e minerais. Entretanto, as cultivares de maior interesse são suscetíveis ao ataque de fitopatógenos. A Sigatoka-amarela, causada pelo fungo Pseudocercospora musae, é uma das doenças mais destrutivas dessa cultura, resultando em perdas consideráveis na produção, afetando principalmente as cultivares do subgrupo Cavendish. A medida de controle mais eficiente é a criação de novas variedades resistentes ao patógeno, e a genômica pode ser uma grande aliada na descoberta de genes candidatos envolvidos em resistência, para que seja realizada sua introgressão em cultivares comerciais. O objetivo desse trabalho foi identificar e caracterizar os genes associados à resistência envolvidos na interação entre Musa acuminata e P. musae, a partir do RNA-seq de M. acuminata subsp. burmannica Calcutta 4. Para isso, folhas de bananeira do genótipo Calcutta 4 (genótipo resistente) e de M. acuminata cv. Cavendish Grande Naine (genótipo suscetível) foram inoculadas com uma suspensão de conídios de P. musae, e mantidas em câmara de crescimento sob condições controladas. O RNA total foliar foi extraído em dois tempos de coleta: 3 e 12 dias após a inoculação. O RNA-seq foi realizado via Illumina Hiseq 4000 e resultou em 325.264.847 reads, e um total de 30.613 genes foram mapeados contra o genoma de referência de M. acuminata ssp. malaccensis var. DH-Pahang. Após a realização das análises de bioinformática, 1.073 genes apresentaram expressão diferencial (DEGs) aos 3 DAI e 976 DEGs foram observados aos 12 DAI, ambos em relação ao controle não inoculado. Dentre estes, 612 genes estão potencialmente envolvidos em respostas de defesa em Calcutta 4, incluindo diversos genes que codificam para receptores PRR, proteínas PR, fatores de transcrição dos tipos WRKY, MYB e NAC, peroxidases, quitinases e genes de resistência (NRLs). A validação da expressão de 14 genes envolvidos nas respostas a estresse biótico identificados in silico foi realizada via RT-qPCR e demonstrou uma manutenção no padrão de expressão observado no RNA-seq. Foram identificados seis genes candidatos para serem introgredidos em Musa, os dois principais codificam um para quitinase e o outro para endoquitinase. Ambos apresentaram superexpressão aos 3 DAI em Calcutta 4 e repressão em Cavendish, sendo genes potencialmente envolvidos nas respostas iniciais de defesa do genótipo resistente ao patógeno, atuando na degradação de quitina, de forma a impedir o avanço do fungo na superfície foliar. Com isso, este estudo será de grande contribuição para a elucidação dos mecanismos de resistência em Musa e beneficiará futuros programas de melhoramento da espécie para a geração de novos genótipos resistentes.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Banana (Musa spp.) is one of the world's most important monocotyledonous crops, providing a source of carbohydrates, fibre, vitamins and minerals, and contributing towards global food security. Whilst wild species are generally fertile, many commercial varieties are sterile. As a result of the limited genetic variation, such cultivars are frequently susceptible to pests and diseases. Sigatoka leaf spot, caused by the fungal pathogen Pseudocercospora musae, is one of the most destructive foliar diseases of Musa, which results in serious economic damage to cultivars in the important Cavendish subgroup, with reduced crop yield and fruit quality. Accessing the genomic information of disease resistant fertile wild genotypes of Musa can improve our understanding of resistance mechanisms and serve as a guide to develop disease resistant commercial cultivars, which is recognized as the most efficient strategy for disease control. The aim of this study was to identify and characterize genetic components of resistance to P. musae in Musa acuminata, using RNA-Seq technology. Leaf RNA samples were extracted from M. acuminata subsp. burmannica Calcutta 4 (resistant genotype) and M. acuminata cv. Cavendish Grande Naine (susceptible genotype) at 3 and 12 days after inoculation (DAI) with fungal conidiospores. Calcutta 4 samples were paired-end sequenced using lllumina HiSeq 4000 technology, which resulted in 325,264,847 reads. In the present study, 30,613 genes were accurately mapped against M. acuminata ssp. malaccensis var. DH-Pahang reference genome. A total of 1,073 differentially expressed genes (DEGs) were identified at 3 DAI, and 976 DEGs were identified at 12 DAI, in relation to non-inoculated controls. 612 DEGs are potentially involved in disease resistance and defense responses to the fungus, including PRR receptors, PR proteins, WRKY, MYB and NAC transcription factors, peroxidases, chitinases and resistance genes (NRLs). Of these, 14 were validated by RT-qPCR, demonstrating that the expression pattern tendencies, at each evaluated time point, were in broad agreement between RNA-Seq and RT-qPCR data for some of the analysed genes. Six candidate defense genes were identified and offer potential for use in development of Sigatoka leaf spot resistant cultivars. Chitinase and endochitinase genes were upregulated at 3 DAI only in the Calcutta 4 genotype, indicating its potential involvement in initial resistance responses to the pathogen, likely resulting in chitin degradation and fungal growth inhibition. DEGs identified as potentially involved in defense responses will contribute to the elucidation of disease resistance mechanisms in the species, benefiting breeding programs for the development of resistant cultivars