Análise comparativa entre isolados de Fonsecaea sp na modulação da resposta imune do hospedeiro : papel das vesículas e componentes extracelulares

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2021.A cromoblastomicose (CBM) é uma micose cutânea e subcutânea crônica, causada por fungos negros, dimórficos e filamentosos da família Dematiaceae. Fonsecaea pedrosoi é considerado uma das principais espécies causadoras da doença no Brasil, apesar de que F. monophora, F. nubica e F. pugnacius terem sido descritas como outras espécies capazes de causar CBM em humanos. Todas estas espécies possuem a capacidade de transitar entre as formas saprofíticas, conídios e hifas, e a forma patogênica do fungo, as células muriformes (MCs). Fatores de virulência produzidos por fungos, como vesículas extracelulares (EVs) e moléculas extracelulares presentes no meio condicionado (CM) vem sendo mais estudados nos últimos anos, apesar de existirem poucas informações sobre o papel destas moléculas extracelulares durante a CBM. Este trabalho visa compreender os padrões imunoestimulatórios in vitro e in vivo causados por EVs e CMs produzidos por F. pedrosoi, F. monophora, F. nubica e F. erecta isolados a partir de conídios e hifas cultivados em meio rico (RM) e meio mínimo (MM), além de analisar o papel dessas moléculas quando produzidas na presença ou ausência de MCs. Em relação as diferentes condições nutricionais de cultivo, foi demonstrado que EVs produzidas em RM tem maior capacidade de estimular a produção de TNF, IL-1β e IL-10 por BMDMs em comparação a EVs produzidas em MM na presença ou na ausência de MCs. Tais resultados são diferentes dos observados para EVs de C. neoformans produzidas em RM e MM, em que EVs isoladas de MM demonstram estimular mais a produção de citocinas pró-inflamatórias do que em RM. Já os CMs demonstram ser mais pró-inflamatórios do que as EVs, principalmente os isolados a partir de MM na ausência de MCs, aumentando os níveis de secreção das citocinas TNF, IL-1β e IL-10 in vitro. Por fim, os CMs produzidos por F. pedrosoi e F. erecta foram utilizados como tratamento in vivo e demonstraram agravar a progressão da CBM em modelo murino, aumentando o diâmetro da área da lesão, o número de unidades formadoras de colônia e os níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1β em relação ao controle positivo tratado com PBS. Já foi observado que as moléculas presentes no CM produzidos pela forma capsular de C. neoformans conseguem inibir a ativação do inflamassoma NLRP3 e promover a proliferação celular in vitro, indicando que as moléculas presentes nos CMs de fungos patogênicos possuem potencial de imunomodular a resposta imune do hospedeiro. Desta forma, observa-se que as EVs e os CMs produzidos por diferentes espécies do gênero Fonsecaea possuem a capacidade tanto de estimular, quanto de inibir a secreção de citocinas importantes na resposta imune inata como TNF, IL-1β e IL-10, demonstrando serem moléculas com capacidade de virulência e possivelmente, de modular a progressão da CBM em humanos.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic cutaneous and subcutaneous mycosis caused by black, dimorphic and filamentous fungi of the Dematiaceae family. Fonsecaea pedrosoi is considered one of the main species causing the disease, although F. monophora, F. nubica and F. pugnacious are considered as other species capable of causing CBM in humans. All these species have an ability to transition between saprophytic forms, such as conidia and hyphae and the pathogenic form of the fungus, the murine cells (MCs). Virulence factors produced by fungi, such as extracellular vesicles (EVs) and conditioned media (CM) have been more studied in recent years, although there is little information about the roles of these extracellular molecules during CBM. This work aims to understand the in vitro and in vivo immunostimulatory patterns caused by EVs and CMs obtained by F. pedrosoi, F. monophora, F. nubica and F. erecta isolated from conidia and hyphae cultivated in rich medium (RM) and minimal medium (MM), in addition to analyzing the role of these molecules when produced in the presence or absence of MCs. Regarding the different nutritional conditions of cultivation, it was shown that EVs produced in RM have a greater capacity to stimulate the production of TNF, IL-1β and IL-10 by BMDMs when compared to EVs produced in MM in the presence or absence of MCs. These results are different from those observed for EVs of C. neoformans produced in RM and MM, in which EVs isolated from MM are shown to stimulate more the production of pro-inflammatory cytokines than in RM. The CMs, on the other hand, demonstrate to be more pro-inflammatory than EVs, especially those isolated from MM in the absence of MCs, which increased the levels of cytokine secretion of TNF, IL-1β and IL-10 in vitro. Finally, the CMs produced from F. pedrosoi and F. erecta were used as an in vivo treatment and where shown to aggravate the progression of CBM in a murine model, increasing the diameter of the lesion area, the number of colony forming units and the levels of pro-inflammatory cytokines such as TNF and IL-1β, compared to the positive control treated with PBS. The role of the molecules presented in the CM produced by capsular C. neoformans has already been observed to inhibit inflamassome NLRP3 activation and promote cell proliferation in vitro, indicating that theses extracellular molecules produced by pathogenic fungi have the potential to immunomodulate the host’s immune response. Thus, it is observed that the EVs produced by different species of the Fonsecaea genus have the ability to both stimulate and inhibit important cytokines in the innate immune response, proving to be molecules with high virulence capacity and possible mediators of the CBM progression in humans