Enriquecimento de proteínas parceiras de KAHRP e mapeamento de proteínas organelares de Plasmodium falciparum utilizando CRISPR-Cas9, APEX2 e proteômica

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2021.A malária é uma doença tropical, causada por espécies do gênero Plasmodium spp. O Plasmodium falciparum é a espécie mais virulenta, pois é a única capaz de produzir o quadro clínico mais grave da doença: a malária cerebral. De acordo com as últimas estimativas, cerca de 229 milhões de pessoas são acometidas pela malária, e, estudos que possam viabilizar a descoberta de novos alvos terapêuticos se tornam altamente necessários, haja vista aos crescentes casos de resistência aos antimaláricos disponíveis. Neste sentido, a fim de poder explorar melhor os parceiros de interação com a proteína KAHRP (do inglês, knob-associated histidine rich protein), uma proteína relacionada à citoaderência ao endotélio do hospedeiro humano facilitando a formação de “rosetas” em P. falciparum, foi implementado o uso de CRISPR-Cas9 juntamente com a abordagem de marcação por proximidade mediada por ascorbato-peroxidase modificada (APEX2), a fim de criar uma proteína quimérica da KAHRP fusionada a APEX2 por knock-in, utilizando o sistema CRISPR-Cas9, com a finalidade de promover a biotinilação de proteínas vizinhas parceiras. Para avaliar a funcionalidade da proteína quimérica KAHRP-Flag-APEX2 , ensaios de validação por Western-blot, estreptavidina-blot e imunofluorescência foram realizados. As análises de proteômica e de bioinformática revelaram que dentre as 208 proteínas do parasita biotiniladas vizinhas da KAHRP-Flag-APEX2, algumas delas são preditas por serem exportadas pelo translocon PTEX presente na membrana do vacúolo parasitóforo, e, outras preditas por serem exportadas por mecanismos não clássicos. Dentre as proteínas observadas, encontramos: GBP130, PTP2, membros do grupo PHISTb, UIS2, Pf332, RESA, as proteínas que compõe o complexo RhopH/CLAG (RhopH1/CLAG3.1, RhopH2 e RhopH3) e do complexo PTEX: PTEX88 e 150. Adicionalmente, seguindo o princípio da acurácia e proximidade proporcionada pelo uso da APEX2, construções similares foram realizadas, a fim de endereçar a HA-APEX2 para algumas organelas de P. falciparum. Pelo fato do parasita apresentar organelas especializadas, tais como o apicoplasto e as roptrias, o conhecimento do arsenal de proteínas presentes nestas estruturas, podem fornecer evidências para que futuras estratégias para a erradicação da doença, baseado no desenvolvimento de quimioterápicos e/ou vacinas sejam realizadas. O uso da APEX2 tem se mostrado altamente eficiente nesse quesito, pois permite uma descrição altamente precisa acerca das proteínas presentes em uma organela de interesse, baseando-se na sua resolução temporal e espacial. Assim, construções epissomais foram adicionalmente obtidas, endereçando a HA- APEX2 para o apicoplasto (pCC1-SP(ACP)-HA-APEX2), a mitocôndria (pCC1-SP(TrxR)-HA-APEX2) e as roptrias (pCC1-SP(RAP1)-HA-APEX2). O controle citosólico também foi obtido (pCC1-HA(cito)- APEX2). Com a mudança da metodologia de transfecção com o uso da plataforma Amaxa II Nucleofector II AAD-1001N (Lonza) e a determinação da ineficácia da droga anti-folato WR99210 proveniente da Sigma-Aldrich para selecionar os parasitas mutantes por [3H] hipoxantina, a obtenção dos parasitas transfectados foi possível após 3-4 semanas de seleção. Os ensaios de validação da expressão e da marcação por biotinilação propiciada pela APEX2 por Western-blot e estreptavidina-blot dos respectivos compartimentos estão em andamento.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Malaria is a tropical disease caused by Plasmodium species. P. falciparum is the most virulent specie from this genus, because is the only one capable to produce the most life-threatening clinical state of the illness: cerebral malaria. In agreement with the last estimative, about 229 million people are diagnosed with malaria worldwide, and studies that might shed light into novel therapeutic strategies turn-out very required, especially when an increasing of the numbers of resistance cases have been reported. Therefore, in order to explore neighboring interacting proteins of KAHRP (knob-associated histidine rich protein), a widely known protein involved with cytoadherence properties onto host endothelium facilitating rosetting in P. falciparum, it was implemented the use of CRISPR-Cas9 system together with proximity-tagging based on the use of ascorbate-peroxidase modified (APEX2), in order to produce a chimeric protein of KAHRP fused to APEX2 by knock-in, allowing biotinylation of neighboring proteins of KAHRP-Flag-APEX2. To assess the activity of this chimeric protein, validation assays were performed, such as Western-blot, streptavidin-blot and immunofluorescence. From our proteomic and bioinformatic analyses, a total of 208 parasite- derived neighboring proteins of KAHRP-Flag-APEX2 were identified. Some of them are predicted to be exported through translocon PTEX at parasitophorous vacuole membrane, and others are predicted to be exported through non-classical mechanisms. Among these proteins, we have found in our subproteomic dataset: GBP130, PTP2, PHISTb members, UIS2, Pf332, RESA, proteins from RhopH/CLAG complex (RhopH1/CLAG3.1, RhopH2 and RhopH3) and PTEX complex: PTEX88 and 150. In addition, taking advantage of the accuracy and proximity labeling allowed by APEX2 technology, similar vector constructions were made, in order to address HA-APEX2 to some P. falciparum compartments. As some compartments of this parasite are unique, such as apicoplast and rhoptries, the knowledge of the proteomic arsenal from these organelles, might provide novel insights for the disease eradication through rational drug design pipelines and/or vaccine development. The use of APEX2 has been shown very insightful in this state-of-the-art, because it allows an accurate description of the protein content of a given compartment, merely based on temporal and spatial resolution of the technology. Thus, episome-based constructions were additionally obtained addressing HA-APEX2 to apicoplast (pCC1-SP(ACP)-HA-APEX2), mitochondrion (pCC1-SP(TrxR)-HA-APEX2) and rhoptries (pCC1-SP(RAP1)-HA-APEX2). A cytosolic episome-based expressing APEX2 was also obtained (pCC1-HA(cito)-APEX2). After changing our transfection platform to Amaxa II Nucleofector II AAD-1001N (Lonza) and with determination of the WR99210 inefficacy purchased from Sigma-Aldrich to select mutant parasites through [3H] hypoxanthine, we were able to obtain the first transfected parasites after 3-4 weeks under drug pressure. Validation assays regarding protein expression and biotinylation proximity tagging into the compartments provided by APEX2 through Western-blot and streptavidin-blot are under progress