Listeriolysine S, une bactériocine dépendante d’un contact produite par des souches hyper-virulentes de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Lm) is a bacterial pathogen that causes listeriosis, a foodborne disease characterized by gastroenteritis, meningitis, bacteremia, and abortions in pregnant women. The most severe human listeriosis outbreaks are associated with a subset of Lm hyper-virulent strains that produce Listeriolysin S (LLS). LLS is a thiazole/oxazole modified microcin (TOMM) that targets specific Gram-positive bacteria, modifies the gut microbiota and allows efficient Lm gut colonization and invasion of deeper organs. The objectives of this work were to investigate the LLS cytotoxic role, the LLS bactericidal mechanism, the mechanism(s) regulating LLS expression, and the contribution of the Lm-specific LlsX protein to the LLS biological activity. We demonstrate that LLS is no cytotoxic for eukaryotic host cells, targeting exclusively prokaryotic cells during in vivo infections. We have identified in silico several putative transcriptional boxes and putative RNA-regulatory elements which could regulate LLS expression. Using subcellular fractionation assays and transmission electron microscopy, we identified that LLS remains associated to the bacterial cell membrane and cytoplasm of LLS-producer bacteria, and it is not secreted to the bacterial extracellular space. Applying trans-well co-culture systems and microfluidic-coupled microscopy, we determined that LLS requires direct contact between LLS-producer and LLS-target bacteria to display bactericidal activity, and it is thus a contact-dependent bacteriocin. We also demonstrate that contact-dependent exposure to LLS leads to permeabilization of the target bacterial cell membrane, promoting target-bacteria growth arrest and lysis. Our results indicate that a net increase in bacterial surface negative charges augments the susceptibility to LLS. Moreover, we revealed the direct interaction between LLS and LlsX at the cell membrane of LLS-producer bacteria, and we show that LlsX is required for expression and/or stabilization of LLS. Overall, our results demonstrate that LLS is the first TOMM that displays a contact-dependent inhibition mechanism, impairing the target cell membrane integrity and targeting exclusively prokaryotic cells during in vivo infections.Listeria monocytogenes (Lm) est un pathogène bactérien responsable de la listériose, une maladie qui induit des gastroentérites, des avortements chez la femme enceinte et des méningites chez le nouveau-né. Les épisodes les plus sévères de listériose sont associés à des souches hyper-virulentes de Lm qui produisent la Listeriolysine S (LLS). La LLS est une microcine modifiée avec des thiazole/oxazoles (TOMM), qui inhibe la croissance de certaines bactéries Gram-positives, modifie la composition du microbiote intestinal et favorise la colonisation de l’intestin et l’invasion d’organes profonds comme le foie et la rate. Mes travaux de thèses ont pour objectifs d’étudier le rôle cytotoxique de la LLS, les mécanismes bactéricides de la LLS, les mécanismes régulateurs de l’expression de la LLS et la contribution de la LlsX, une protéine spécifique de Lm, dans l’activité biologique de la LLS. Nos résultats ont montré que la LLS cible exclusivement des cellules procaryotes et ne présente aucune activité cytotoxique pour les cellules eucaryotes in vivo au cours de l’infection par Lm. Nous avons identifié in silico de boîtes de régulation transcriptionnelle putatives et des ARNs régulateurs putatifs qui pourraient être impliqués dans le contrôle de l'expression de la LLS. Par microscopie électronique et fractionnement subcellulaire des bactéries productrices de la LLS, j’ai pu montrer que la LLS est localisée au niveau de la membrane de la bactérie productrice et n’est pas secrétée dans le surnageant. En utilisant un insert de culture cellulaire Transwell et une approche de microscopie micro-fluidique en temps réel, j’ai pu également montrer que la LLS inhibe la croissance bactérienne de manière dépendante d’un contact entre la bactérie productrice de LLS et la bactérie cible. Mes travaux ont montré également que la LLS induit la perméabilisation des membranes des bactéries cibles, produit l'arrêt de leur croissance et provoque leur lyse. Nos résultats indiquent qu'une augmentation des charges négatives de la surface bactérienne augmente la sensibilité à la LLS. De plus, nous avons montré une interaction directe entre la LLS et LlsX au niveau de la membrane cellulaire des bactéries productrices de LLS et que LlsX est nécessaire à l'expression et la stabilisation de la LLS. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que LLS est la première TOMM qui présente un mécanisme d'inhibition dépendant d’un contact, que la LLS altère l'intégrité de la membrane de la cellule cible et agit exclusivement contre les cellules procaryotes lors d’une infection in vivo