Macrophage activation by and degradation studies of the Skin2 dermal matrix

Tese Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica), 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO transplante de pele é de extrema importância para os pacientes que sofrem de perda severa de pele. Globalmente, o número de incidentes de queimaduras severas ao ponto de necessitar de tratamentos médicos ultrapassa o número de incidentes de tuberculose e VIH combinados. O transplante de pele por autoenxerto consiste em transferir pele de uma secção de uma área do corpo para outra, e apesar de suas limitações (necessidade de um procedimento cirúrgico adicional, disponibilidade limitada, e dor do local de extração), representa um método versátil e dinâmico de reconstrução cutânea, e continua a ser o tratamento padrão para lesões graves de pele. Embora tenham sido desenvolvidos e comercializados tratamentos regenerativos competentes, estes ainda apresentam limitações anatómicas, funcionais e estéticas. Esta dissertação está envolvida no desenvolvimento da camada dérmica de um substituto biossintético da pele: Skin2, mais concretamente, estudando a interação entre materiais candidatos a constituir este substituto dérmico com as células do sistema imunitário, nomeadamente a diferenciação destas células em contacto com os materiais e a degradação destes materiais por parte destas células. Os monócitos são células do sistema imunitário que se diferenciam em macrófagos aquando do contacto com agentes patogénicos. Estes dois tipos de células estão entre as primeiras linhas de defesa contra corpos estranhos ao organismo, e desempenham um papel crucial na natureza da sua resposta a estes corpos estranhos, podendo induzir uma resposta inflamatória ou regenerativa. Sendo um enxerto de uma camada dérmica considerado um corpo estranho ao organismo, torna-se relevante estudar as interações entre os materiais candidatos a formar esta camada dérmica, e as células que determinam a natureza da resposta a estes materiais. O objetivo desta tese foi estudar as interações entre macrófagos diferenciados a partir de monócitos (THP-1) e scaffolds celulares produzidos em laboratório por eletrofiação, nomeadamente: Viabilidade da linha celular monocítica THP-1, tal como a sua diferenciação em macrófagos e a polarização dos mesmos em fenótipo inflamatório ou regenerativo (M1 ou M2, respectivamente), quando em scaffolds produzidos com diferentes materiais e misturas desses materiais; Diferenças morfológicas dos macrófagos nos scaffolds, com diferentes materiais; A erosão gerada pelos macrófagos nos scaffolds. Os materiais usados na eletrofiação foram dois polímeros de origem natural – Gelatina de pele de peixe de água fria (GEL), e Quitosano (CS) – e um polímero de origem sintética – poli-ε-caprolactona (PCL) – sendo cada um dos materiais usado individualmente ou sendo os materiais misturados entre si em misturas binárias ou ternárias. Os scaffolds produzidos foram depois reticulados com glutaraldeído (GTA) se tivessem CS ou GEL, de forma a manter as suas propriedades físicas, e cada um deles foi mais tarde semeado com células THP-1, em duas condições: com e sem adição de forbol-12-miristato-13- acetato (PMA), que induz a diferenciação de monócitos em macrófagos. Numa primeira fase de cultura, foi semeada uma réplica de cada condição (cada scaffold e controlos com e sem PMA) por sementeira, e foi verificada a viabilidade celular em cada material ao fim de 48 horas através do teste de resazurina. Estas sementeiras foram repetidas várias vezes, com a perspetiva de obter coerência de resultados com repetição do mesmo procedimento, solidificando quaisquer conclusões que pudessem ser retiradas dos mesmos. No entanto, esta coerência de resultados não se verificou, tendo-se verificado uma grande variabilidade nas viabilidades celulares para os mesmos materiais em sementeiras diferentes. Devido ao facto de se terem gasto todos os materiais produzidos por eletrofiação nesta primeira fase, foi tentado um outro método de produção de materiais, teoricamente mais fácil e mais rápido: produção de filmes por evaporação de solvente. Os filmes a serem produzidos teriam, idealmente, a mesma composição química que os scaffolds de PCL, apenas alterando a morfologia em que os polímeros estavam dispostos. No entanto, a produção destes filmes tornou-se um desafio maior do que o previsto, tendo em conta que os filmes que continham PCL apresentavam uma clara separação de fases devido à imiscibilidade dos polímeros, o que fez com que fossem adicionados alguns compostos às soluções, como o Poly(óxido de etileno), visando torná-las mais viscosas, de forma a atenuar esta separação de fases, homogeneizando o filme. Esta tentativa de homogeneização não teve sucesso, pelo que a produção de filmes poliméricos foi abandonada e os materiais voltaram a ser produzidos por eletrofiação. Foram ainda medidas as quantidades de endotoxinas em soluções poliméricas com os materiais utilizados em electrofiação, de forma a verificar quais destes continham valores de endotoxinas acima do limite médico (0,5 unidades de endotoxina por mililitro – EU/mL). Foi verificado que apenas a solução de GEL se encontrava acima deste limite, com 1,1 UE/mL na solução de concentração 1% (m/m) e com 1,5 EU/mL na solução de concentração 2%, enquanto as soluções de PCL e CS se encontravam dentro dos limites médicos, com a mesma concentração de 0,065 UE/mL. As endotoxinas foram removidas de GEL de duas formas: adição de peróxido de hidrogénio a uma solução de GEL que viria mais tarde a ser eletrofiada, e através do tratamento desidrotérmico (DHT) após a deposição da matriz por electrofiação. No entanto, a remoção das endotoxinas com a adição de peróxido de hidrogénio impossibilitou a subsequente eletrofiação do material para produção do scaffold. Seguiu-se então uma segunda fase de cultura, que passou a ser feita de acordo com um novo procedimento, sendo semeadas em cada sementeira 5 réplicas do mesmo material com PMA e 5 réplicas sem PMA, bem como controlos com e sem PMA, e sendo adicionado à cultura o material GEL com tratamento DHT. Após 48 horas, as células não aderidas foram retiradas dos poços e contadas, e foi feito o teste de resazurina com as células aderentes. Após este teste, foi adicionado meio de cultura aos poços, e o teste voltou a ser feito passadas 120 horas, de forma a verificar se a viabilidade se mantém ao longo do tempo. Os novos resultados de viabilidade mostram que todos os materiais são viáveis, sendo que no scaffold de GEL que realizou tratamento desidrotérmico e no scaffold de PCL, há um aumento da viabilidade celular das 48 para 120 horas de cultura, sugerindo uma viabilidade prolongada nestes materiais, em contraste com os restantes, que apresentaram uma ligeira descida. Além disso, a estimativa das taxas de adesão mostra que scaffolds com misturas de polímeros tendem a promover maior adesão celular do que os scaffolds unitários. Numa última fase, foi realizada microscopia de fluorescência com a finalidade de observar diferenças na morfologia celular dos macrófagos nos diferentes materiais, bem como na sua distribuição ao longo dos mesmos ao fim de 48 e 120 horas de cultura. No entanto, devido à elevada autofluorescência dos scaffolds de CS e de GEL no comprimento de onda de 555 nm (vermelho), a aquisição de imagens foi dificultada, bem como o seu tratamento. Apesar de ter sido possível obter imagens de microscopia de fluorescência, não são percetíveis quaisquer alterações morfológicas entre as células nos diferentes materiais. Em relação à erosão gerada por macrófagos nos scaffolds, não foi observada qualquer degradação em microscopia eletrónica de varrimento (SEM). No entanto, os resultados do SEM possibilitaram uma observação mais clara da morfologia dos macrófagos e permitiram estimar o seu fenótipo, de forma mais evidente do que com microscopia de fluorescência. A adição de PMA induz uma morfologia principalmente inflamatória (M1) nos macrófagos, com células arredondadas. Sem a adição de PMA, o fenótipo dominante aparenta ser o fenótipo inativado (M0) para os scaffolds unitários e para o scaffolds de CS GEL, e M1 para os scaffolds de CS PCL, GEL PCL, para a matriz ternária.Autograft skin transplantation is still the standard treatment for severe skin loss, despite its limitations. Although competent regenerative therapies have been developed and commercialized, they still present anatomical, functional and aesthetic limitations. This dissertation addresses the development of the dermal layer of a biosynthetic skin substitute: Skin2. The goal of this dissertation was to study the interactions between monocytes, which would later differentiate into macrophages, and cell scaffolds produced in-house via electrospinning, namely: THP-1 monocytic cell line viability and macrophage differentiation and polarization in inflammatory or regenerative (M1 or M2) phenotypes when seeded in the scaffolds, which were produced using different materials and mixtures of these materials; macrophage morphological differences amongst the different scaffolds; macrophage generated erosion on these scaffolds. The materials used in electrospinning were gelatin from cold water fish skin (GEL), chitosan (CS), and Poly-ε-caprolactone (PCL), either singularly or mixed with each other in binary or ternary mixes. The scaffolds produced were then crosslinked with glutaraldehyde (GTA) if they had CS or GEL in order to maintain their physical properties, and seeded with THP-1 cells under two conditions: with and without the addition of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), which induces monocytes differentiation into macrophages. Viability results show that all materials are viable, and in GEL that underwent dehydrothermal treatment (DHT) and PCL, there is an increase in viability from 48 to 120 hours of culture, suggesting prolonged viability. Additionally, adhesion rates estimation shows that polymer blends tend to promote more cell adhesion compared to single polymer scaffolds. Regarding macrophage generated erosion on the scaffolds, nothing could be observed under Scanning Electronic Microscopy (SEM). However, SEM results provided a clear observation of macrophages morphology and allowed to estimate their phenotype, clearer than fluorescence microscopy. Addition of PMA mainly induced a regenerative (M1) macrophage morphology, with cells presenting a round shape. When PMA is not added, the predominant phenotype morphology is M0 (inactivated) for unitary scaffolds and for CS GEL, and M1 for CS PCL, GEL PCL, and ternary mix