Oxidative stress response enzymes: unravelling catalytic determinants through natural and site directed mutants

Tese de Mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs redutases do superóxido (SOR) são enzimas que catalisam a redução do superóxido a peróxido de hidrogénio. Estes enzimas podem possuir um (1Fe-SOR) ou dois (2Fe-SOR) átomos de ferro não-hémico. Nos enzimas 2Fe-SOR, os átomos de ferro integram dois centros distintos: centro desulforedoxina (centro I) e neelaredoxina (centro II, catalítico). No centro II o átomo de ferro é coordenado por quatro histidinas equatoriais e uma cisteína axial. No centro I, semelhante à desulforedoxina de D. gigas, o ferro é coordenado pelos átomos de enxofre provenientes das quatro cisteínas ligantes do motivo de ligação, CX2CX15CC. As características espectroscópicas destes enzimas dependem da incorporação de átomos de ferro nos centros. O centro desulforedoxina oxidado exibe bandas de absorção a 307 e 503 nm, com um ombro a 560 nm, enquanto que, o centro neelaredoxina apresenta bandas de absorção a ~560 nm, ou ~660 nm, na presença de um glutamato ligado ao centro, conferindo a cor azul aos enzimas 1Fe-SOR. Da análise de sequência de aminoácidos, o enzima de Korarchaeum cryptofilum (Kc SOR) é previsto ser uma SOR com dois centros de ferro (centros I e II), sendo que uma das histidinas ligantes do centro II está substituída por uma serina. Adicionalmente, o enzima Kc SOR possui um domínio extra na região do C-terminal, cuja função é ainda desconhecida. Este trabalho teve como foco principal a caracterização deste enzima, nomeadamente no papel que o seu centro catalítico não canónico e domínio extra têm na sua actividade enzimática. Foram realizados testes de expressão para definir quais as melhores condições de expressão deste enzima, seguindo-se produção proteica em grande escala, com a adição de suplementos de ferro e posteriores etapas de purificação da proteína em estudo. No entanto, a caracterização bioquímica desta proteína revelou uma incorporação incompleta de ferro no centro II, sendo que cada proteína possuía ~1.40 átomos de ferro, como determinado por ICP-AES, em vez do esperado de uma 2Fe SOR, ou seja, 2 ferro por proteína. Este resultado é corroborado por análise espectroscópica de: UV visível, que demonstra características espetrais apenas do centro desulferoxina, mesmo com adição de um oxidante forte (peróxido de hidrogénio), a contribuição do centro II não foi observada; e de Ressonância Paramagnética Eletrónica (RPE), que comparando com a literatura, mostra apenas características da contribuição do centro I. A ausência do átomo de ferro ou a presença de um metal diferente no centro II não-canónico, são duas justificações para estes resultados. As SORs têm a capacidade de incorporar diferentes metais para além de ferro, nomeadamente zinco, que por sua vez, não contribuiria o espectro UV-Visível, no entanto, a quantificação efectuada pelo ICP-AES, ~0.05 átomos de zinco por molécula de proteína, permite concluir a ausência deste metal no centro neelaredoxina. Este resultado conduz à hipótese da ausência de metal no centro catalítico. Como tal, para analisar a capacidade deste enzima de incorporar átomos de outros metais, a expressão desta proteína foi repetida com a adição de diferentes suplementos metálicos, como zinco, níquel, cobre e cobalto. Os crescimentos com cobre e zinco não foram bem-sucedidos, verificado por análise por gel SDS-PAGE e espectros de UV-Visível. O crescimento com níquel foi bem-sucedido, mas as análises com os mesmos métodos mostraram uma expressão proteica muito reduzida. A expressão da Kc SOR com os suplementos ferro e cobalto foi bem-sucedida. Resultados da análise por UV-Visível quando comparados com a literatura, mostraram características concordantes com incorporação de átomos de cobalto. Contudo, comparativamente com a literatura disponível não foi possível concluir o centro onde ocorreu a incorporação dos átomos de cobalto. Para determinar os elementos espectrais promovidos pela presença de cobalto no centro II, foi produzido um mutante de uma 1Fe-SOR canónica, H46S de Archaeoglobus fulgidus que, ao substituir uma histidina por uma serina, gera um centro II não-canónico semelhante ao verificado no Kc SOR. Este mutante foi expresso com suplementação de ferro ou cobalto. Este mutante foi capaz de incorporar cobalto no centro II, mas incapaz de ligar ferro. O tipo selvagem por outro lado, foi capaz de incorporar átomos de ferro, mas incapaz de incorporar cobalto. A incorporação de cobalto no mutante, foi verificada por determinação de metais através de ICP-AES: ~0.91 átomos de cobalto por proteína. As características espectrais observadas por UV-visível e RPE também suportam a incorporação de cobalto. Comparação entre as características espectroscópicas da Kc SOR suplementada com ferro e cobalto e o mutante Af H46S suplementado com cobalto, apontam pequenas diferenças entre elas, que juntamente com os dados da literatura da rubredoxina e desulforedoxina com incorporação de átomos de cobalto, indicam que para a Kc SOR com suplementação de ferro e cobalto, a incorporação de átomos de cobalto ocorra apenas no centro I. Para verificar se existiria influência do domínio extra na incorporação de metais no centro II, foi expresso o mutante Kc SOR S70H com suplemento de ferro, em que o centro II não-canónico foi convertido à forma canónica, com as quatro histidinas equatoriais e a cisteína axial. Os dados de espectroscopia de UV-visível e RPE são semelhantes aos obtidos para o tipo selvagem da Kc SOR também suplementado com ferro. Em conjunto com os resultados obtidos por ICP-AES, ~0.28 átomos de ferro por proteína, é possível concluir que não ocorreu incorporação de ferro no centro II canónico. Estes resultados levam à hipótese de uma influência do domínio extra na capacidade de incorporação de metal no centro II. Para confirmar esta hipótese, foi feita uma tentativa para esclarecer a estrutura da Kc SOR por cristalografia de raios-X. Infelizmente, cristais obtidos deste enzima não possuíam qualidade de difração suficiente para a determinação da sua estrutura. Foi, no entanto, possível determinar a estrutura da Af mutante, H46S, suplementada com cobalto. A estrutura tridimensional determinada, confirmou a incorporação de átomos de cobalto no centro neelaredoxina, com a coordenação de três histidinas e de uma cisteína axial, sendo quase sobreponível com a do tipo selvagem, com a excepção do resíduo mutado. Sendo um novo centro catalítico nunca visto numa SOR, a capacidade de dismutação de superóxido das proteínas em estudo foi avaliada por eletroforese em gel PAGE-nativo seguido de coloração com nitroazul de tetrazólio. Os resultados demonstram a ausência de actividade de dismutação para o tipo selvagem da Kc SOR suplementado com ferro e com ferro e cobalto, e para o mutante Kc S70H suplementado com ferro, sendo, porém, inconclusivos para o mutante Af SOR H46S suplementada com cobalto. Juntamente com os dados que confirmam a incorporação bem-sucedida de cobalto na Af SOR H46S, pode especular-se que este enzima pode requerer um substrato diferente. Neste trabalho foi possível concluir, que a Kc SOR parece ser incapaz de incorporar ferro, o cofator característico de redutases do superóxido, tanto tipo selvagem como no mutante S70H. Os resultados obtidos parecem indicar a hipótese de que o domínio extra na região do C-terminal pode ter implicações na incorporação de metais no centro catalítico. Além do ferro, este enzima foi incapaz de incorporar outros metais, podendo afetar a capacidade de usar superóxido como substrato para a actividade enzimática. O mutante Af H46S, com átomos de cobalto incorporados no centro II, foi incapaz de usar superóxido como substrato, este sugere que a incorporação de cobalto impede a actividade de dismutação do superóxido e, consequentemente, a possibilidade deste enzima com este centro não-canónico usar um substrato diferente.Superoxide reductases (SOR) are non-heme iron enzymes that can have one (1Fe-SOR) or two (2Fe-SOR) iron atoms and are capable to catalyse the one-electron reduction of O2 • −, to hydrogen peroxide. In 2Fe-SORs, the iron atoms, are present in two different centres, the desulforedoxin and the neelaredoxin centre, or centre I and II respectively. In the neelaredoxin centre, which is the catalytic centre in SORs, the iron atom is coordinated by four equatorial histidines and a fifth axial cysteine ligand. On the other hand, in the desulforedoxin centre, which is similar to the D. gigas desulforedoxin, the iron is coordinated by the sulphur atoms from the four cysteine ligands, with the binding motif CX2CX15CC. From the amino acid sequence analysis, Korarchaeum cryptofilum SOR is predicted to be a 2Fe-SOR, but one of the ligand histidines is substituted by one serine, raising the question of whether this protein is able to bind iron at the centre II. Besides this difference in the catalytic centre, Kc SOR also has an extra domain in the C-terminal region of the protein. The role of this domain is still unknown. Biochemical characterisation of the overexpressed protein, including metal analysis indicate an incomplete iron incorporation (~1.4 iron per protein by ICP-AES). This was corroborated by UV visible and EPR spectroscopies, in which it was demonstrated the single contribution of centre I. Supplementation with different metals was attempted in order to evaluate Kc SOR’s ability to incorporate other metals than iron. Incorporation of cobalt was verified by UV-visible and EPR spectroscopies and a content of ~0.4 cobalt per protein was determined. In order to deconvolute the spectral features of the hypothetically cobalt-bound centre II, a site-directed mutant of a canonical 1Fe-SOR from Archaeoglobus fulgidus, H46S, which mimics the non-canonical centre II of Kc SOR, was produced and expressed in the presence of cobalt or iron. This protein was able to bind cobalt but not iron, as was verified by ICP-AES, presenting a value of ~0.91 cobalt atoms per protein. The UV-Vis and EPR spectra features of this protein corroborates cobalt incorporation. The crystallographic structure determined for this mutant is almost superimposable to the one from the wild type, apart from the histidine that was substituted by a serine. The density arising from the presence of the cobalt ions was also verified. A site directed mutant of the Kc SOR, S70H, was also produced in order to convert the catalytic centre into a canonical one and to evaluate its ability to bind iron. UV-visible and EPR spectroscopies demonstrated similar features to the wild-type protein. Together with the results of ~0.27 iron per protein obtained by ICP-AES, this indicates, once again, that no metal incorporation occurred in centre II. A native gel electrophoresis was used to evaluate a possible superoxide dismutase activity of Kc SOR, Kc S70H and Af H46S. The results showed that no SOD activity was detected for the Kc SOR supplemented with iron, Kc SOR supplemented with iron and cobalt or Kc S70H supplemented with iron. In the case of the Af mutant H46S, supplemented with cobalt, the data was inconclusive