Evaluación de los efectos producidos en diferentes niveles de organización biológica en Daphnia magna tras la exposición al fungicida procloraz y al insecticida piriproxifen

Desde hace décadas, el uso de plaguicidas sintéticos ha permitido optimizar el rendimiento en la producción de alimentos y continúa siendo la forma más rentable de prevenir y/o erradicar las plagas que amenazan su viabilidad y prosperidad. Lamentablemente, casi tres cuartas partes de los recursos hídricos dulceacuícolas son destinados a la producción agrícola, convirtiéndose así en una de las principales vías por la que los plaguicidas acceden al medio acuático natural. En España, dos de los plaguicidas de mayor uso son el fungicida procloraz y el insecticida piriproxifen. Ambos detectados en diferentes sistemas fluviales como los ríos Ebro, Guadalquivir, o Turia. Su llegada a estos ecosistemas tiene lugar por diferentes vías que incluyen; de forma indirecta escorrentías o lixiviaciones, o de forma directa su aplicación en cultivos inundados como los arrozales o fumigaciones para el control de plagas de insectos como el mosquito tigre. Su uso está respaldado por los estudios ecotoxicológicos exigidos por las legislaciones vigentes, aunque no resultan suficientes para evaluar el alcance de los daños en el entorno ecológico, y sobre poblaciones animales no diana como los invertebrados acuáticos, entre otros. Por ello la ampliación de los estudios ecotoxicológicos es una herramienta imprescindible para ahondar en el conocimiento de los daños sobre los ecosistemas por la introducción de estos factores químicos. Como consumidor primario y componente del zooplancton en multitud de ecosistemas dulceacuícolas planetarios se encuentra el género Daphnia. Más concretamente, Daphnia magna pertenece desde hace décadas al grupo de organismos bioindicadores de la contaminación, entre otros motivos por su alta sensibilidad a bajas concentraciones de numerosos compuestos contaminantes, incluidos los plaguicidas. La facilidad de su cultivo y mantenimiento en laboratorio, y la producción de descendencia homogénea (hembras partenogenéticas), lo convierten en un modelo muy adecuado para el estudio de los efectos producidos por compuestos xenobióticos. La presente investigación ha evaluado desde un punto de vista ecotoxicológico, de forma separada, el efecto del fungicida procloraz y el insecticida piriproxifen, utilizando como animal experimental individuos de la especie D. magna. Los efectos producidos en esta especie se han valorado a nivel agudo y a nivel crónico con exposiciones subletales. Se han utilizado para ello diferentes herramientas biológicas como la determinación de la mortalidad (CE50), el estudio del comportamiento alimenticio el efecto sobre la reproducción o el crecimiento individual, así como la evaluación de diversas alteraciones fisiológicas a través de parámetros bioquímicos. Por último, se realizaron estudios sobre la expresión génica. Todo ello utilizando dos generaciones de dáfnidos, una generación parental (F0) y una generación filial (F1) para así poder también evaluar el efecto de la transferencia entre generaciones. De la determinación de las CE50 a 24 y 48 horas para cada uno de los plaguicidas se seleccionaron las concentraciones subletales a emplear. Se escogieron las mismas concentraciones fraccionales de la CE50 a 48 horas siendo éstas 9.23 mg/L y 336.48 µg/L para procloraz y piriproxifen respectivamente. Se realizó el estudio crónico estandarizado con el seguimiento de los efectos sobre los dáfnidos, incluyendo los parámetros reproductivos como tamaño de la camada, nº de camadas, tiempo a la primera puesta, nº de neonatos por hembra, longevidad y longitud, y el parámetro poblacional r. Del mismo modo, se realizaron las experiencias para la determinación de los parámetros bioquímicos y genéticos tras exponer durante 21 días a los animales a las concentraciones subletales ensayadas en el estudio de ecotoxicología crónico. En este estudio se investigaron los efectos producidos en los parámetros bioquímicos: proteínas, colesterol, triglicéridos, glucosa, lactato y LDH. Y la expresión génica de los genes que codifican la síntesis de vitelogeninas, metalotioneinas, glutatión-S-transferasa, catalasa, proteínas de choque térmico, proteínas relacionadas con el metabolismo lipídico, y hemoglobina. Para la valoración de la transmisión vertical madre-hija se llevó a cabo el estudio sobre la progenie F1 de las dafnias expuestas a la concentración más elevada de cada uno de los tóxicos. Transcurrido el tiempo de exposición de las madres (21 días) se seleccionaron neonatos (F1) al azar que fueron divididos en dos grupos: uno sometido a la misma concentración que las progenitoras y otro transferido a agua libre de plaguicida, durante los 21 días de ensayo, estudiando exactamente los mismos parámetros individuales, reproductivos y poblaciones que con la generación F0. Con ello se valoró la capacidad de recuperación y/o repercusiones de una exposición reiterada sobre individuos de la generación F1. En todos los ensayos se procedió al estudio de la morfología de la progenie, mediante la observación de estado vivo/muerto, su sexo y/o malformaciones. En el caso del fungicida procloraz, los resultados mostraron que la exposición continuada durante 21 días no mostró alteraciones en los parámetros reproductivos de las madres (F0), mientras que el tamaño individual alcanzado al finalizar los experimentos fue menor. El análisis bioquímico y genético sobre F0 evidenciaron un aumento en los requerimientos energéticos por parte de los animales con un aumento de los niveles de proteína totales, de la glucosa y la actividad LDH ésta última pareja a la disminución de los niveles de lactato; todo ello informativo de la vía de movilización de carbohidratos, probablemente como resultado del estrés provocado por la presencia del fungicida a concentraciones subletales en el medio. El estudio genético evidenció en las dafnias expuestas la sobreexpresión de los genes involucrados en la síntesis de las proteínas de choque térmico y hemoglobina, junto con la inhibición de la expresión de las metalotioneinas esto último estaría siendo informativo del impacto a nivel genómico de la exposición continuada. Por otro lado, la exposición del fungicida procloraz sobre las madres, se trasladó en un efecto sobre la descendencia F1 apareciendo neonatos malformados en relación directa con la concentración de exposición al fungicida. Por su parte, el estudio de la transferencia vertical madre-hija al comparar F1 no tratadas con F1 tratadas, ambas descendientes de F0 tratadas, derivó que, en ambos casos, varios de los parámetros reproductivos resultaron alterados tras los 21 días de experimento. El insecticida piriproxifen, utilizado a las mismas concentraciones fraccionales que el fungicida, resultó muy tóxico en el ensayo crónico de reproducción para la generación F0, con una acusada reducción de los diferentes parámetros estudiados (disminución de la progenie, disminución en el tamaño de los individuos, y cambio gradual en la coloración relacionado con la concentración ensayada de insecticida). Las hembras tratadas (F0) produjeron una descendencia íntegramente formada por neonatos con malformaciones en diferentes grados. El estudio de los parámetros bioquímicos y la expresión génica en esta generación F0 avaló los resultados obtenidos en el ensayo crónico reproductivo. El metabolito colesterol se redujo en los individuos expuestos en varias de las concentraciones ensayadas. La expresión genética de los genes involucrados en la síntesis de las proteínas de choque térmico, metabolismo lipídico, vitelogeninas, y estrés oxidativo resultaron inhibidas. Se produjo una sobreexpresión génica para los genes codificantes de hemoglobina (lo que avalaría el incremento gradual de coloración observado en los animales expuestos a concentraciones crecientes de insecticida). Del estudio de la generación F1, se observó la transferencia vertical madre-hija derivada de la exposición al insecticida. En los individuos F1 crecidos en ausencia de insecticida, se observó una rápida recuperación, llegando en algunos casos incluso a alcanzar valores equivalentes a los del grupo control, mientras que en los individuos F1 pre-expuestos durante 21 días a la misma concentración que las madres los parámetros de estudio, individuales, reproductivos y el poblacional r, estuvieron reducidos en igual grado que sus madres. Los resultados del presente estudio ponen de manifiesto la necesidad de no limitarse únicamente a los estudios de toxicidad agua, o a los ensayos de reproducción sobre una única cohorte, siendo importante incluir otra tipología de ensayos que abarquen no solo más niveles biológicos, sino también más cohortes de la especie objeto de estudio