Otimização de técnicas de processamento de sémen criopreservado

Mestrado em Tecnologias Clínico-LaboratoriaisIntrodução: A preservação de espermatozóides tem sido efectuada nos laboratórios de procriação medicamente assistida (PMA) com recurso ao SlowFreezing, técnica gold standard para a criopreservação de gâmetas masculinos. No entanto, esta técnica não está isenta de inconvenientes: a citotoxicidade dos crioprotectores, a morosidade de processamento e oneroso investimento dos aparelhos automatizados. Estudos científicos emergem e apontam para a técnica de vitrificação como uma alternativa à criopreservação de espermatozoides mediante Slow-Freezing, desviando-se das limitações desta técnica. Objetivo: Com recurso à técnica de vitrificação, o objetivo desta investigação é o de delinear um protocolo de vitrificação de rápida execução e de obtenção de taxas de recuperação de espermatozoides moveis, viáveis na utilização de técnicas de PMA. Metodologia: Este é um estudo experimental, de amostragem não probabilística e racional para análise das taxas de sobrevivência dos espermatozóides, após exposição de amostras a diferentes concentrações de soluções de sacarose, trealose e glicerol e após o processo de vitrificação ultrarrápida e aquecimento, avaliando diferentes suportes de vitrificação, tempos de exposição e temperaturas de aquecimento de modo a obter uma razão entre estas variáveis que permita desenhar um protocolo base para a vitrificação de espermatozóides. Os resultados foram tratados com Microsoft Excel®, no domínio da estatística descritiva e, para inferência estatística, com One-Way Anova na análise do efeito crioprotetor das diferentes soluções. Resultados: A solução de sacarose de 0,1M, apresenta entre as soluções a estudo e após exposição até 5 minutos, um melhor efeito crioprotetor até ao mergulho em azoto líquido em suporte de Cryotop®. O aquecimento do produto de vitrificação é exequível em gota de 5 µL de solução tamponada, a 37°C ou à temperatura ambiente desde que o aquecimento seja realizado em caixa e com sobreposição de óleo mineral. Conclusão: Este estudo revela que se é possível gradualmente transferir a abordagem de criopreservação no sentido da vitrificação de espermatozóides elaborando um protocolo de fácil execução, para utilização em tratamentos procedimentos de PMA.ABSTRACT - Introduction: Sperm preservation has been carried out using the Slow-Freezing technique, defined by the World Health Organization, as the gold standard of sperm cryopreservation. Despite the definition and dissemination of Slow-Freezing protocols by assisted reproductive laboratories, the cytotoxicity of cryoprotectants used, the time-consuming processing, an expensive investment. Increasingly, scientific studies point to the technique of vitrification as an alternative to the cryopreservation of sperm, which devices from the limitations of Slow-Freezing and also exceeds some of the limitations of Slow-Freezing because It is effective for a broader specter of samples. Objective: Using the vitrification technique, the objective of this research is to define a protocol with a high survival rate based on motility. Methodology: This is an experimental, non-probabilistic, and rational sampling study for evaluation of survival rates, based on motility, after exposure of samples to different solutions of sucrose, trehalose, and glycerol for determination of cryoprotectant medium, vitrification support, exposure time, and heating temperature suitable for an optimized protocol. The data obtained were treated with Microsoft Excel for descriptive statistics and with One-Way Anova for statistical comparison of the cryoprotectant effect of the different solutions. Results: The results of this experimental work suggest that, of all the solutions, the 0.1M sucrose solution is adequate to exert the cryoprotective effect and that, the balance between this protective and cytotoxic effect is maintained up to 5 minutes after exposure of the sample before the dip in liquid nitrogen. Cryotop support is suitable for vitrification and thaw of 1 μL of the sample. The thawing of the vitrified product is feasible in a drop of 5 μL, at 37°C or at room temperature provided that the thawing is performed in a dish with mineral oil overlap. Conclusion: This study revealed that it is possible to transfer the sperm vitrification approach to a new paradigm by elaborating an easy-to-execute protocol, less time consumption, and practical recovery rates that can be used directly in ART treatments.N/