Funktionelle Charakterisierung der Intramembranprotease Signal Peptide Peptidase-like 2c

Proteasen sind aufgrund ihrer regulatorischen und degradierenden Funktionen Schlüsselenzyme einer Vielzahl von zellbiologischen Prozessen. Intramembranproteasen prozessieren ihre Substrate innerhalb deren hydrophober Transmembrandomäne. Die Proteinfamilie der Aspartyl-Intramembranproteasen besteht aus den Presenilinen, der Signal Peptide Peptidase (SPP) sowie ihrer vier Homologen, Signal Peptide Peptidase-like 2a-c und SPPL3. Die SPPL2-Proteasen sind u.a. für die Maturierung von B-Zellen und dendritischen Zellen in vivo beteiligt. Zudem sind sie in die Prozessierung eines proatherogenen endothelialen Rezeptors involviert. SPPL2c (Signal Peptide Peptidase Like 2c) ist ein nur gering charakterisiertes Protein, dessen Gen aufgrund seiner intronlosen und SNP-reichen Struktur als ein mögliches Pseudogen angesehen wurde. Ziel dieser Arbeit war es, grundlegende zellbiologische Eigenschaften des Proteins und dessen mögliche Gewebeexpression zu untersuchen sowie eine Phänotypisierung der SPPL2c-defizienten Maus vorzunehmen. Bei heterologer Überexpression zeigte sich eine Lokalisation des SPPL2c-Proteins im Endoplasmatischen Retikulum. Mittels ortsspezifischer Mutagenese wurde eine N-Glykosylierung des Proteins an N106 nachgewiesen. Für die Analyse einer proteolytischen Prozessierung möglicher Substrate wurde ein Ko-Expressionssystem in Modellzellen eingesetzt. Als Substratkandidaten wurden u.a. ER-ständige Typ-II-Transmembranproteine, die bei einer Ansammlung fehlgefalteter Proteine vermehrt exprimiert werden, untersucht. Bei den untersuchten Proteinen ergaben sich jedoch keine Hinweise auf eine Prozessierung durch die Protease SPPL2c. Bei Western-Blotting-Analysen der Hauptorgansysteme von Mäusen wurde das SPPL2c-Protein ausschließlich im murinen Testis nachgewiesen. Mittels RT-PCR wurde diese limitierte Expression bestätigt, wobei sich im weiblichen Reproduktionstrakt keine Expression des SPPL2c-Gens fand. Unter Zuhilfenahme eines β-Galaktosidase-Reportersystems wurden Hinweise auf eine Expression von SPPL2c innerhalb der Tubuli seminiferi, des Keimepithels, gewonnen. Durch immunhistochemische Verfahren konnte das SPPL2c-Protein in Vorläuferzellen der Spermatozoa, den elongierten Spermatiden, detektiert werden. Phänotypisch hatte das Fehlen des SPPL2c-Proteins eher milde Auswirkungen auf den murinen Organismus: Reduziert waren u.a. die Zahl der elongierter Spermatiden pro Tubulus sowie das Hodengewicht im Verhältnis zum Gesamtgewicht. Zusätzlich war die Motilität der maturen Spermien vermindert. Funktionell deutet dies auf eine mögliche Involvierung des SPPL2c-Proteins bei der Bewegungserzeugung der Spermien hin. Die Defizienz des SPPL2c-Proteins sorgte zudem für eine moderate Fertilitätseinschränkung der Tiere; die Zahl der Nachkommen aus Verpaarungen von SPPL2c-/--Männchen mit SPPL2c-/--Weibchen war im Vergleich zu den Wildtypverpaarungen reduziert. Neben SPPL2c wurden, abgesehen von SPPL3, auch die anderen Mitglieder der SPPL-Familie im Hoden detektiert. Die genaue Lokalisation dieser Proteine innerhalb des Testis konnte jedoch nicht sicher dargestellt werden. Eine mögliche Kompensation des Ausfalls von SPPL2c durch die ebenfalls ER-ständige SPP erschien indes unwahrscheinlich, da diese Protease sowohl in Wildtyp- als auch in SPPL2c-/--Mäusen nicht innerhalb der Tubuli seminiferi detektiert wurde. Zusammenfassend konnte mit dieser Charakterisierung des SPPL2c-Proteins die physiologische Bedeutung der SPPL2-Proteasen um den männlichen Reproduktionstrakt erweitert werden. Zukünftige Studien könnten die Interaktion von SPPL2c mit den Proteinen Phospholamban und Syntaxin 8 im Hinblick auf der Spermatogenese näher untersuchen. Diese Tail-anchored Proteine wurden bei der weiteren Untersuchung der SPPL2c-defizienten Maus als physiologische Substrate der Protease identifiziert. Zudem ließen sich mittels Promotoranalysen Faktoren identifizieren, die eine Expression des SPPL2c-Gens induzieren können. Schließlich könnte die Generierung und Analyse einer SPPL2a/b/c-defizienten Maus weitere Hinweise auf die (patho-)physiologischen Funktionen dieser Proteasen im Rahmen der männlichen Reproduktion liefern