Nouvelles combinaisons de β-lactamines et inhibiteurs de β-lactamase : vers un nouveau traitement des infections à Mycobacterium abscessus chez les patients atteints de mucoviscidose

Mycobacterium abscessus, a rapidly growing mycobacteria, is responsible for pulmonary infections in cystic fibrosis patients. The recommended treatment consists in an initial phase with the combination of a carbapenem (imipenem), a macrolide (azithromycin), an aminoglycoside (amikacin), and a glycylcycline (tigecycline). The team has investigated the optimization of treatments involving β-lactams and have demonstrated that avibactam, a 2nd generation β-lactamase inhibitor belonging to the diazabicyclooctane (DBO) family, inhibits the β-lactamase BlaMab produced by M. abscessus and substantially increases the efficacy of imipenem both in vitro, intracellularly, and in a zebrafish model. Expression of the β-lactamase gene was found to be induced in infected macrophages. The aim of my PhD project was to evaluate the efficacy of new β-lactam-β-lactamase inhibitor combinations and to investigate β-lactamase regulation in macrophages. In the first part of the thesis, new antibiotic combinations were evaluated in vitro and in macrophages infected by M. abscessus. Rifabutin, usually used in the treatment of infections due to other mycobacteria, showed synergistic activity with imipenem in vitro but the combination was not bactericidal. In infected macrophages, rifabutin enhanced the activity of imipenem and the addition of avibactam led to increased killing. Tedizolid, developed for the treatment of staphylococcal infections, displayed weak synergy in vitro but no bactericidal activity against M. abscessus. In macrophages, tedizolid enhanced the activity of imipenem and the imipenem-tedizolid-rifabutin-avibactam quadruple combination afforded 91% intracellular killing. Finally, the association of imipenem with relebactam, a new β-lactamase inhibitor developed in combination with imipenem, was found to be as active as the imipenem-avibactam both in vitro and in macrophage model. The second part of the thesis was focused on the identification of the stressor triggering the induction of β-lactamase production in macrophages. M. abscessus was grown in vitro in different culture media mimicking stress conditions thought to prevail in macrophages. The β-lactamase specific activity was determined using a chromogenic β-lactam (nitrocefin) as the substrate. None of the physicochemical conditions that were tested led to induction, including acidic pH, high concentrations of metals, oxidative stress or β-lactams. The last objective was to study the impact of the N versus G polymorphism located in the conserved SDN motif of mycobacterial β-lactamases on activity of β-lactam-β-lactamase inhibitor combinations. BlaMab from M. abscessus contains motif SDN whereas BlaC from M. tuberculosis contains motif SDG, a polymorphism that determines efficacious inhibition by either avibactam of clavulanate, respectively. Two isogenic strains of M. abscessus were constructed by allelic exchange. In comparison to the wild-type enzyme, the strain producing BlaMab with the N to G substitution was less susceptible to the β-lactam-avibactam combinations but more efficaciously inhibited by combinations comprising clavulanate. In the context of BlaC, the G to N substitution potentiated inhibition by avibactam. These results establish that the SDN/SDG polymorphism determines the efficacy of combinations comprising a β-lactam and avibactam or clavulanate, as expected from previous kinetic studies performed with purified β-lactamases. N to G and G to N substitutions might be mechanisms of resistance acquisition in M. abscessus and M. tuberculosis, respectively.Mycobacterium abscessus, une mycobactérie à croissance rapide, est responsable d'infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose. Le traitement recommandé comprend une phase initiale basée sur l'association d'un carbapénème (imipénème), d'un macrolide (azithromycine), d'un aminoside (amikacine) et d'une glycylcycline (tigécycline). L’équipe a étudié l’optimisation des traitements impliquant les β-lactamines et a démontré que l’avibactam, un inhibiteur de β-lactamases de 2ème génération appartenant à la famille du diazabicyclooctane, inhibe le β-lactamase BlaMab produit par M. abscessus et augmente de manière significative l’efficacité de l'imipénème à la fois in vitro, dans les macrophages et dans le modèle de poisson zèbre. L'expression du gène de la β-lactamase s'est avérée être induite dans les macrophages infectés. L'objectif du projet de thèse était d'évaluer l'efficacité de nouvelles combinaisons comprenant des d'inhibiteurs de β-lactamase et d'étudier la régulation de la β-lactamase dans les macrophages. Dans la première partie de la thèse, de nouvelles combinaisons d'antibiotiques ont été évaluées in vitro et dans des macrophages infectés par M. abscessus. La rifabutine, habituellement utilisée dans le traitement d'infections dues à d'autres mycobactéries, a montré une activité synergique avec l'imipénème in vitro, mais l'association n'était pas bactéricide. Dans les macrophages infectés, la rifabutine a renforcé l'activité de l'imipénème et l'ajout d'avibactam a entraîné une diminution du nombre de bactérie intracellulaire. Le tédizolide, développé pour le traitement des infections à staphylocoques, a montré une faible synergie in vitro mais pas d’activité bactéricide contre M. abscessus. Dans les macrophages, le tédizolide augmentait l'activité de l'imipénème et la quadruple combinaison imipénème-tédizolide-rifabutine-avibactam permettait de diminuer le nombre de bactéries intracellulaires de 91%. Enfin, l'association de l'imipénème avec le relebactam, un nouvel inhibiteur de β-lactamases développé en association avec l'imipénème, s'est révélée aussi active que la combinaison imipénème-avibactam à la fois in vitro et dans les macrophages. La deuxième partie de la thèse était focalisée sur l'identification du stress responsable de l'induction de la production de β-lactamase dans les macrophages. Dans ce but, M. abscessus a été cultivée in vitro dans différents milieux de culture mimant des conditions de stress aux quelles la bactérie est potentiellement confrontée dans les macrophages. L'activité spécifique de la β-lactamase a été déterminée en utilisant comme substrat une β-lactamine chromogène, la nitrocéfine. Aucune des conditions physicochimiques testées n'a conduit à une induction, incluant un pH acide, de fortes concentrations de métaux, un stress oxydatif ou la présence de β-lactamines. Le dernier objectif était d’étudier l’impact du polymorphisme N versus G situé dans le motif conservé SDN des β-lactamases sur l’activité des combinaisons comprenant une β-lactamine et un inhibiteur de β-lactamase. BlaMab de M. abscessus contient le motif SDN alors que BlaC de M. tuberculosis contient le motif SDG, un polymorphisme qui détermine l'efficacité de l'inhibition de BlaMab par l'avibactam de BlaC par le clavulanate in vitro. Deux souches isogéniques de M. abscessus ont été construites par échange allélique. Comparativement à la souche sauvage, la souche produisant BlaMab avec la substitution N vers G était moins sensible aux combinaisons comprenant l’avibactam avec, en parallèle, un gain d’efficacité pour les combinaisons comprenant le clavulanate. Dans le contexte de BlaC, la substitution de G vers N a potentialisé l'inhibition par l'avibactam. Ces résultats établissent que le polymorphisme SDN/SDG détermine en partie l'efficacité des β-lactamines associées à l'avibactam ou au clavulanate, en accord avec les études cinétiques précédemment réalisées in vitro avec des β-lactamases purifiées