Mécanismes moléculaires du contrôle de l'arborisation axonale par une régulation post-traductionnelle de la kinase LKB1

Neuronal connectivity forms the basis of neuronal functions and is a consequence of neuronal morphology. Neuronal development defects result in neurodevelopmental diseases such as schizophrenia or autism. In this context, the fundamental question of my thesis was to understand how neuronal morphology is acquired during development by the identification of molecular mechanism leading to the regulation of axonal morphology. Acquisition of specific pattern of axonal morphology is regulated by coordination of intracellular signaling pathway and extracellular cues such as neurotrophines or guidance molecules. The LKB1 kinase (Liver Kinase B1) is a master kinase involved in the acquisition of neuronal morphology. Yet the extracellular factors ensuring the regulation of LKB1-dependent signaling pathway in the axon remain largely unknown. An extracellular cue is involved in LKB1-dependent neuronal polarity : the neurotrophin BDNF. Moreover, BDNF regulates axon branching as LKB1. Axon branching regulation by LKB1 involved the activation of NUAK1 kinase. Thus, we hypothesized that BDNF regulates axon branching by the regulation of LKB1 and NUAK1. A candidate-approach technic allowed us to show that BDNF-induced axon branching and mitochondria regulation is dependent on LKB1/NUAK1 signaling. A BDNF neurons treatment leads to an increase in axonal branching and mitochondria metabolism and we show that these regulations are dependent to LKB1 and NUAK1. Moreover, BDNF- induces S431 phosphorylation on LKB1, and this phosphorylation is mediated by the MAP kinase ERK. A gene replacement strategy allowed us to show that S431 site on LKB1 is necessary for axon branching and mitochondria trafficking in vitro. Then, we used in utero electroporation linked to gene replacement strategy in vivo. We observed that expression of S431A mutant rescue axon branching in ipsilateral side in layer V whereas S431A mutant failed to rescue axonal branching of layers II/III in the contralateral side. Finally, we reported that mice mutant S431A have altered terminal axon branching and behavior. Taken together, these results allowed a better understanding in BDNF signalization for axon branching and suggest a local regulation participates in the balance between ipsilateral and contralateral axonal projectionsLe cerveau est un organe majeur chez l'Homme, il est composé de différentes parties dont le cortex, qui représente la plus grande partie du cerveau et qui est le siège de fonctions cognitives supérieures comme la mémoire ou le langage. Ces fonctions sont permises par un réseau de neurones interconnectés dont l'unité de base est le neurone. La neuroscience est l'étude de la biologie cellulaire et fonctionnelle du cerveau et a pour objectif la compréhension des neurones. La connectivité neuronale est une conséquence de la morphologie neuronale et est à la base des fonctions cognitives,. Ainsi dans ce cadre, la question fondamentale de ma thèse est de comprendre comment se forme ces structures en étudiant les mécanismes moléculaires induisant cette morphologie. La morphologie neuronale est contrôlée par des voies de signalisation intracellulaires qui servent de relais entre les fonctions biologiques et les facteurs extracellulaires. Durant ma thèse j'ai donc cherché à comprendre comment, au cours de la formation de l'axone, les neurones vont corréler l'activation extracellulaire et les voies de signalisations intracellulaires. Pour cela j'ai étudié deux paradigmes le premier, un facteur extracellulaire : le BDNF, et une kinase intracellulaire LKB1. Le premier axe de ma thèse s'est basé sur l'observation d'un défaut de branchement cortical dans des mutants LKB1. Une diminution de l'expression de LKB1, induit un phénotype fort de perte de branchement cortical in vivo en ipsilatéral et en contralatéral. Cette diminution du nombre de branches est médié par la kinase NUAK1. Cependant il a été observé qu'une diminution de l'expression de NUAK1 induit un phénotype plus faible de diminution du branchement. Avec l'utilisation du mutant LKB1 S431A un phénotype identique au phénotype de NUAK1 est retrouvé. Suite à cette observation, j'ai cherché à comprendre à quels mécanismes ce défaut de branchement pouvait être due. Ce site S431 est un site connu pour être phosphorylé suite à la fixation du BDNF sur son récepteur TrkB. Ainsi, nous avons tout d'abord cherché à voir si cette phosphorylation et l'effet sur le branchement était spécifique au BDNF dans les neurones corticaux. Pour cela dans un premier temps j'ai réalisé des cultures de neurones corticaux que j'ai traité avec différents facteurs de croissance comme IGF-1, TGF et BDNF et j'ai observé la phosphorylation du site S431 par Western Blot. Dans un second temps j'ai réalisé des cultures de neurones corticaux traités ou non avec du BDNF dans des conditions en absence de LKB1 ou NUAK1. Ainsi j'ai pu montrer que seul le BDNF permet la phosphorylation du site S431 et que le branchement induit par le BDNF in vitro était dépendant de LKB1 et NUAK1. Par la suite, j'ai voulu comprendre par le biais de quelle kinase la phosphorylation du site S431 était induite. Pour cela j'ai utilisé des cultures de neurones corticaux que j'ai traité avec différents inhibiteurs de kinase connues pour être activées par le BDNF telles que : PKA, ERK, et le récepteur au BDNF : TrkB. Ainsi j'ai pu observer après western blot que la phosphorylation de LKB1 induite par le BDNF n'était pas induite lorsque le récepteur était inhibé et en présence de l'inhibiteur de ERK. J'ai donc pu conclure que le récepteur TrkB est en amont de LKB1 et que l'intermédiaire entre TrkB et LKB1 était la kinase ER