Caracterización endócrina y biología molecular del endometrio durante el diestro y la gestación temprana en la yegua

La hipótesis de esta tesis fue que la fisiología uterina (en términos de expresión génica y proteica de receptores esteroideos sexuales) depende de la localización del endometrio respecto del lado del cuerpo el lúteo (CL) (Artículo I). Además, postulamos que la presencia del embrión modula muy tempranamente la expresión endometrial de genes y proteínas que participan en procesos fisiológicos que contribuyen al desarrollo embrionario y a la mantención de la preñez (Artículos I, II y III). Finalmente, nos planteamos que este efecto es ejercido en tipos celulares endometriales de forma específica (Artículos I y III). Se realizaron biopsias transcervicales para recoger endometrio del cuerno uterino ipsilateral y contralateral (respecto al lado del CL) en el día 13 después de la ovulación en yeguas cíclicas (n = 6) y preñadas (n = 6) (Artículo I), y únicamente del cuerno ipsilateral en los días 7, 10 y 13 postovulación en yeguas cíclicas (n = 6 en cada día) y preñadas (n = 6 en cada día) (Artículos II y III). Las muestras de sangre se tomaron diariamente desde el día 0 hasta el día 13 para las determinaciones de 17ß-estradiol (E2) y progesterona (P4) (Artículo I) y para el factor de crecimiento insulínico 1 (IGF1), leptina y adiponectina (Artículo II). Se midió el inmunomarcado y niveles de transcriptos endometriales ipsi y contralaterales del receptor de estrógeno ? (RE?) y del receptor de progesterona (RP) al día 13 después de la ovulación (Artículo I). Los niveles de transcriptos endometriales ipsilaterales de RE?, RP, progestin y adipoQ receptor family member V (PAQR5), receptor de oxitocina (ROXT), prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (PTGS2), factor de crecimiento fibroblastico tipo 9 (FGF9), IGF1 y su receptor (RIGF1), mucina 1 (MUC1), osteopontina (OPN), receptor de leptina (RLEP), receptores de adiponectina 1 y 2 (R1 y R2ADIPO), proto-oncogen raf-1 (RAF1) y serine/threonine protein kinasa 6/p21-activated kinase 6 (PAK6) se evaluaron en los días 7 y 13 post ovulación (Artículo II). La cantidad de células del sistema inmune y la localización y abundancia de proteínas por inmunohistoquímica para RP, RE?, ROXT, PTGS2, IGF1, IGF2, RIGF1 y MUC1 en los días 7, 10 y 13 después de la ovulación fueron analizadas en el Artículo III. Las concentraciones de E2, P4, IGF1, leptina o adiponectina no se vieron afectadas por el estado reproductivo (Artículos I y II) La expresión y localización RE?, así como el mRNA del RP en yeguas preñadas, se redujeron en el cuerno ipsilateral en comparación con el contralateral (Artículo I). Las yeguas preñadas mostraron menor expresión génica de RE? y PR que el grupo cíclico, mientras que para los demás genes hubo mayor expresión en las preñadas. La preñez afectó todos los genes al día 7, con la excepción del RP (Artículo II). La preñez y/o las interacciones con el status mostraron un efecto en la intensidad de tinción de todas las proteínas analizadas. Además, las yeguas preñadas mostraron mayor número de linfocitos, con una disminución hacia el día 13 de preñez. El efecto de la preñez sobre las células inflamatorias y los marcadores moleculares fue más evidente en los compartimentos superficiales, en los leucocitos al día 7 y en la localización al día 10 post ovulación (Artículo III). Los resultados confirman que el embrión equino ejerce una regulación de parácrina (sin cambios sistémicos en las hormonas determinadas) sobre genes y las proteínas que están vinculadas a procesos biológicos esenciales como la inmunomodulación, la angiogénesis, el crecimiento y metabolismo endometrial y embrionario, sugiriendo que su fluctuación acompaña cambios y requerimientos específicos del desarrollo embrionario. Esta regulación comienza pronto después de entrar al útero, por lo que difiere del concepto más aceptado sobre una respuesta más tardía del endometrio a la presencia del embrión.Our hypothesis was that uterine physiology (in term of steroid receptors transcript expression and protein levels) depends endometrial localization regarding side of corpus luteum (CL) (Paper I). Besides, we postulated that the presence of the embryo could exert an early effect on several genes and proteins related to embryo development and pregnancy maintenance (Paper I, II and III). Finally, we hypothesized this effect could be exerted specifically in certain endometrial cell-types (Paper I and III). Transcervical biopsies were performed to collect endometrium ipsilateral and contralateral regarding the side of corpus luteum on day 13 postovulation in cyclic (n=6) and pregnant (n=6) mares (Paper I) and exclusively of the ipsilateral horn on days 7, 10 and 13 post ovulation in cyclic (n=6 on each day) and pregnant mares (n=6 on each day) (Papers II and III). Blood samples were collected daily from day 0 until the day 13 for 17ß-estradiol (E2) and progesterone (P4) determinations (Paper I) and for insulin growth factor 1 (IGF1), leptin and adiponectin determinations (Paper II). Immunohistochemical and transcriptional ipsi and contralateral endometrial levels of estrogen receptor α (ERα) and progesterone receptor (PR) where measured at day 13 post-ovulation in Paper I. Transcriptional ipsilateral endometrial expression of ERα, PR, progestin and adipoQ receptor family member V (PAQR5), oxytocin receptor (OXTR), prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), fibroblast growth factor family member 9 (FGF9), IGF1 and its receptor (IGF1R), mucin 1 (MUC1), osteopontin (OPN), leptin receptor (RLEP), adiponectin receptors 1 and 2 (RADIPO1 and 2), raf-1 proto-oncogene (RAF1) y serine/threonine protein kinase 6/p21-activated kinase 6 (PAK6) was assessed at days 7 and 13 post ovulation in Paper II and ipsilateral endometrial immunological cell infiltration and immunohistochemical protein localization for PR, ERα, OXTR, PTGS2, IGF1, IGF2, IGF1R and MUC1 was done at days 7, 10 and 13 post-ovulation (Paper III).Serum E2,P4 IGF1, leptin and adiponectin concentrations were not affected by reproductive status (Papers I and II). ERα protein and transcript expression, as well as PR mRNA in pregnant mares was reduced in the ipsilateral horn as compared to the contralateral horn (Paper I). Pregnant mares showed lower ERα and PR mRNA transcript expression than the cyclic group, while the remaining genes showed an upregulation. Pregnancy affected all genes on day 7, with the exception of PR mRNA (Paper II).Pregnancy and/or the interactions found with status shows an effect in staining intensity of all proteins studied. Moreover, pregnant mares showed higher numbers of lymphocytes and a downregulation was observed towards day 13. The effect of pregnancy on immune cell population molecular markers was more evident on the superficial, at day 7 in leukocytes and at day 10 post ovulation in protein localization (Paper III). Results confirm that the equine embryo exert a paracrine regulation (without any systemic changes in the analysed hormones) on genes and proteins related to key biological process as immunomodulation, angiogenesis, endometrial and embryo growth and metabolism, suggesting their fluctuation escort specific embryo developmental changes and requirements. This regulations starts soon after the embryo enters the uterus, which challenged the more accepted knowledge regarding the endometrial later response to the presence of the embryo