Construction and characterization in vitro of a bicistronic retroviral vector coding endostatin and interleukin-2 for use in gene therapy

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0A terapia g??nica tem sido empregada em estudos pr??-cl??nicos e cl??nicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doen??a. Vetores retrovirais s??o uma ferramenta de transfer??ncia g??nica largamente utilizada. Vetores bicistr??nicos s??o uma alternativa interessante para o tratamento de doen??as complexas. Na constru????o de um vetor bicistr??nico pode-se empregar v??rias estrat??gias dentre elas a utiliza????o da sequ??ncia IRES. A endostatina, fragmento do col??geno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiog??nica devido sua a????o inibit??ria no crescimento de c??lulas endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a prolifera????o de linf??citos T, tem sido utilizada em diversos estudos pr??-cl??nicos e cl??nicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistr??nico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequ??ncia IRES. A constru????o do vetor foi realizada em tr??s etapas, sendo comprovada a constru????o final por an??lise de restri????o e seq??enciamento. C??lulas de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdu????o na c??lula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de an??lise da express??o por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor constru??do apresentou altos n??veis de titula????o viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determina????o da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89μg/106cels.24h, respectivamente. A express??o da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior ?? apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibi????o da prolifera????o de 40% das c??lulas endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma prolifera????o de 10.6% de linf??citos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a constru????o obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do c??ncer e novas estrat??gias terap??uticas.Dissertacao (Mestrado)IPEN/DInstituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/S