Effect of Aloe vera on in vitro cultivation and cryopreservation of preantral follicles included in bovines ovarian tissue

The objective of this work was to evaluate the effects of the addition of Aloe vera on in vitro culture and on the cryopreservation of pre-antral follicles included in bovines ovarian tissue on the activation and development, viability, morphological integrity, configuration of the extracellular matrix (EC) and mRNA expression for SOD, CAT, PRDX6 and GPX1. The study was carried out in two stages. In step I, in situ cultivation was performed, where the ovarian cortex was divided into fragments of approximately 3x3x1 mm, which were then cultured for 6 days in 24-well plates containing 1 ml of α-MEM+ medium alone or supplemented with different concentrations of Aloe vera (1%, 5%, 10% and 50%). At the end of the cultivation period, the fragments were submitted to histological analysis for morphological evaluation and follicular development, in addition to the EC analysis. In step II, ovarian fragments were cryopreserved by the method of vitrification on a solid surface with only the medium for vitrification alone or with this medium supplemented with the two best concentrations of Aloe vera from step I and thawed after two weeks. After thawing, the vitrified fragments were subjected to the same evaluations performed for fragments cultured in vitro in step I, in addition to the viability analysis using calcein and ethidium homidimer, gene expression for SOD, CAT, PRDX6 and GPX1 and capacity for follicular activation and development after cryopreservation using an in vitro culture for 6 days. Regarding step I, the results showed that treatment with 50% Aloe vera showed better rates of morphologically normal follicles than treatment with 10% Aloe vera. However, better rates of activation and follicular development were observed at a concentration of 10% in comparison with the other concentrations used. In addition, the 10% and 50% concentrations of Aloe vera maintained collagen levels in the tissue similar to the fresh control. Regarding step II, it was observed that the presence of 10% of Aloe vera in the vitrification solution maintained better rates of healthy follicles. In addition, both concentrations tested maintained collagen levels similar to fresh control, increased levels of mRNA for SOD, PRDX6 and GPX1 and significantly higher follicular activation rates than that seen in the group without Aloe vera. In conclusion, the presence of Aloe vera in the in vitro culture medium and in the vitrification solution improves the overall quality of the follicle and ovarian tissue, maintaining viability and promoting follicular activation and development, in addition to greater expression of important associated genes oxidative stress.O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da adição de Aloe vera no cultivo in vitro e na criopreservação de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano de bovinos sobre a ativação e desenvolvimento, viabilidade, integridade morfológica, configuração da matriz extracelular (MEC) e expressão de mRNA para SOD, CAT, PRDX6 e GPX1. A execução do estudo ocorreu em duas etapas. Na etapa I realizou-se o cultivo in situ, onde o córtex ovariano foi dividido em fragmentos de aproximadamente 3x3x1 mm que foram, em seguida, cultivados por 6 dias em placas de 24 poços contendo 1 ml de meio α-MEM+ sozinho ou suplementado com diferentes concentrações de Aloe vera (1%, 5%, 10% e 50%). Ao final do período de cultivo, os fragmentos foram submetidos à análise histológica para avaliação morfológica e desenvolvimento folicular, além da análise da MEC. Na etapa II, fragmentos ovarianos foram criopreservados pelo método de vitrificação em superfície sólida com apenas o meio para vitrificação sozinho ou suplementado com as duas melhores concentrações de Aloe vera da etapa I e descongelados após duas semanas. Após a descongelação, os fragmentos vitrificados foram submetidos às mesmas avaliações realizadas para os fragmentos cultivados in vitro na etapa I, além da análise de viabilidade utilizando-se calceína e etídio homodímero, expressão gênica para SOD, CAT, PRDX6 e GPX1 e capacidade de ativação e desenvolvimento folicular após a criopreservação utilizando-se, para isso, um cultivo in vitro durante 6 dias. Em relação à etapa I, os resultados mostraram que o tratamento com 50% de Aloe vera apresentou melhores taxas de folículos morfologicamente normais do que o tratamento com 10% de Aloe vera. Contudo, melhores taxas de ativação e desenvolvimento folicular foram observadas na concentração de 10% na comparação com as demais concentrações utilizadas. Somado a isso, as concentrações de 10% e 50% de Aloe vera mantiveram níveis de colágeno no tecido semelhantes ao controle fresco. Com relação à etapa II foi observado que a presença de 10% de Aloe vera na solução de vitrificação manteve melhores taxas de folículos saudáveis. Além disso, ambas as concentrações testadas mantiveram níveis de colágeno similares ao controle fresco, níveis aumentados de mRNA para SOD, PRDX6 e GPX1 e taxas de ativação folicular significativamente mais altas do que a observada no grupo sem Aloe vera. Em conclusão, a presença da Aloe vera no meio de cultivo in vitro e na solução de vitrificação melhora a qualidade geral do folículo e do tecido ovariano, mantendo a viabilidade e promovendo ativação e desenvolvimento folicular, além de maior expressão de importantes genes associados ao estresse oxidativo