Estudo farmacológico pré-clínico de análogos de LASSBio-1586 candidatos a protótipos de fármacos anticâncer

In Brazil, the estimate for the biennium 2016-2017 indicates the occurrence of 600.000 new cases of cancer. Combretastatin A4 (CA-4), found in the bark of Combretum caffrum, is the compound with simpler chemical structure known to exert potent cytotoxic activity, through reversible interaction with the colchicine site of β-tubulin. In recent years, it has been studied and pointed with great potential anticancer. Thus, this study aims to evaluate the cytotoxic effect of analogous compounds of LASSBio-1586, a promising anticancer prototype, CA-4 analogue, study possible mechanisms involved and to evaluate some pharmacokinetic parameters in cancer cell lines with and without overexpression of tyrosine protein kinases. Using as a selection criterion the selectivity for tumor type and/or cytotoxic potency was selected compounds LASSBio-1918 and LASSBio-1920 and cell lines of colorectal cancer (HCT-116) without overexpression of tyrosine kinases and of non-small cell lung cancer overexpressing EGFR L858R mutation to (PC-9). The results of cytotoxicity obtained by the MTT technique showed that, in incubation time of 48 hours, LASSBio-1918 had IC50 values of 15.81μM and 15.5μM while LASSBio-1920 had IC50 values of 2.7μM and 1.0μM, in HCT- 116 and PC-9, respectively. LASSBio-1918 showed selectivity index of 1.15 and 10.61, while LASSBio-1920 showed 2.3 and 2.1 index in HCT-116 and PC-9, respectively. In these cell lines, analysis of the cell cycle profile, membrane integrity, externalization of phosphatidylserine and expression of PARP protein, suggested that the cytotoxic effect of these compounds is associated with death by apoptosis, with sale cycle stop cell in G2 / M profile similar to the CA-4. The evaluation of the profile of inhibition of tubulin polymerization showed that LASSBio-1920, the compound with higher power cytotoxic, at a concentration of 10μM, inhibit the polymerization of tubulin, showing inhibition profile similar to LASSBio-1586 at 30μM, while that LASSBio-1918 presented profile to cause inhibition only in the concentration of 30μM. Importantly LASSBio-1920 did not show multitargeted profile, because it had no second target protein kinase EGFR (wild type). Regarding studies of permeability and stability, LASSBio-1920 was absorbed into bloodbrain artificial barrier (Permeability Coefficient = 11:48) and artificial barrier of the gastrointestinal tract (Absorbed Fraction = 99.7%). This compound was also stable in medium buffered to pH7.4 and rat plasma and was significantly metabolized only in the microsomal fraction in the presence of NADPH-generating system (cofactor), indicating the action of FMO (flavin-containing monooxygenase) and / or cytochromes P450. The studies of molecular anchoring suggested that LASSBio-1586 and LASSBio-1920 have interaction modes similar to colchicine site on the β-tubulin protein and as expected, the non-polar interactions in the lipophilic pocket of colchicine binding site are important, appear to be essential to explain the higher potency of cytotoxic LASSBio-1920 compared to LASSBio- 1586. Thus, we can conclude that the LASSBio-1920 compound is a lead candidate to be optimized and other tests should be performed for a determination of their antitumor activity in vivo model as well as for the determination of toxicological parameters and evaluation of additional mechanism of action , targeting EGFR mutated.A estimativa no Brasil, para o biênio 2016-2017, aponta a ocorrência de cerca de 600 mil casos novos de câncer. A combretastatina A4(CA-4), encontrada na casca do Combretum caffrum, é o composto de estrutura química mais simples conhecido por exercer potente atividade citotóxica, através da interação reversível com o sítio colchicina da β-tubulina. Nos últimos anos, vem sendo estudada e apontada com grande potencial anticâncer. Com isso, esse estudo tem por finalidade avaliar o efeito citotóxico de compostos análogos de LASSBio-1586, um promissor protótipo anticâncer análogo de CA-4, bem como estudar possíveis mecanismos de ação envolvidos e avaliar alguns parâmetros farmacocinéticos, em linhagens de câncer com e sem superexpressão de proteínas tirosinas cinases. Utilizando como critério seletividade para linhagem tumoral e potência citotóxica selecionou-se, da série de treze análogos em estudo, os compostos LASSBio-1918 e LASSBio-1920 e as linhagens celulares de câncer colorretal (HCT-116), sem superexpressão de tirosinas cinases e de câncer de pulmão de não pequenas células, com superexpressão de EGFR com mutação L858R (PC- 9). Os resultados de citotoxicidade, obtidos pela técnica de MTT, evidenciaram que, no tempo de incubação de 48 horas, LASSBio-1918 apresentou valores de CI50 de 15.81µM e 15.5µM, enquanto LASSBio-1920 apresentou valores de CI50 de 2.7µM e 1.0µM, nas linhagens HCT- 116 e PC-9, respectivamente. LASSBio-1918 apresentou índice de seletividade, de 1.15 e 10.61, enquanto LASSBio-1920 apresentou índice de 2.3 e 2.1, em HCT-116 e PC-9, respectivamente. Nessas linhagens celulares, a análise em conjunto do perfil do ciclo celular, da integridade de membrana, externalização da fosfatidilserina e expressão da proteína PARP, sugeriu que o efeito citotóxico desses compostos está relacionado com processo de morte por apoptose, com promoção de parada de ciclo celular em G2/M, perfil semelhante ao de CA-4. A avaliação do perfil de inibição de polimerização da tubulina mostrou que LASSBio-1920, o composto com maior potência citotóxica da série, na concentração de 10µM, inibiu a polimerização de tubulina, apresentando perfil de inibição semelhante ao de LASSBio-1586 à 30µM, enquanto que LASSBio-1918 foi capaz de causar inibição apenas na concentração de 30µM. É importante destacar que LASSBio-1920 não apresentou como segundo alvo a proteína cinase EGFR (tipo selvagem). Em relação aos estudos de permeabilidade e estabilidade, LASSBio-1920 foi absorvido em barreira artificial hematoencefálica (Coeficiente de permeabilidade = 11.48) e em barreira artificial de trato gastrointestinal (Fração absorvida= 99,7%). Esse composto também se mostrou estável em meio tamponado pH7.4 e em plasma de rato, sendo significativamente metabolizado na fração microssomal apenas na presença do sistema gerador de NADPH (cofator), indicando a ação de FMO (flavina-monoxigenases) e/ou do citocromo P450. Os estudos realizados de ancoramento molecular sugeriram que LASSBio-1586 e LASSBio-1920 apresentam modos de interação semelhantes no sítio da colchicina na proteína β-tubulina e como esperado, as interações nãopolares no bolsão lipofílico do sítio de ligação da colchicina são importantes e parecem ser essenciais para explicar a maior potência citotóxica de LASSBio-1920 em comparação com LASSBio-1586. Assim, podemos concluir que o composto LASSBio-1920 é um candidato líder a ser otimizado e outros testes devem ser realizados para uma determinação de sua atividade antitumoral em modelo in vivo, bem como para determinação de parâmetros toxicológicos e para avaliação de mecanismo de ação adicional, tendo como alvo EGFR mutado