Gene expression analysis for casbene synthese in Jatropha curcas genotypes with contrasting content of phorbol esters

Jatropha curcas has a great economic potential due to its high oil and protein seeds content. However, the presence of toxic diterpenes, phorbol esters (PE), precludes the employment of the oil extraction residue into animal feed. PE biosynthesis has not yet been elucidated, casbene synthase is known to be involved in this biosynthetic pathway, and its product casbene is the most likely precursor to PE. In J. curcas, expression of none of the genes for caspase synthase has been found in seeds, but was reported to leaves and roots, the probable sites for PE synthesis. In order to evaluate the involvement of casbene synthase in regulation of PE biosynthesis and its accumulation, two genotypes with contrasting PE content were compared for the relative expression of casbene synthase genes in root and leaf. Nine genes were expressed in root and one was also expressed in leaf in both genotypes. The relative expression of casbene synthase in leaf was five times higher for the high PE content genotype, whereas in roots there was no significant difference for the relative expression between the genotypes. These results indicate that the leaves probably contribute significantly to PE biosynthesis and that the activity of casbene synthase in the regulation of phorbol esters biosynthesis is not determined transcriptionally. Additionally, we evaluated the efficiency of several protocols for in situ hybridization and in situ PCR in J. curcas aiming contribute to the development of in situ gene expression analysis techniques for this species. However, several obstacles were encountered to obtain satisfactory results. These techniques require a lot of time to be optimized as all adaptations must be empirically tested, which is very time and resource consuming and are often restricted to specific tissues and genes.Jatropha curcas possui um grande potencial econômico devido ao elevado teor de óleo e proteínas de suas sementes. No entanto, a presença de diterpenos tóxicos nas sementes desta planta, os ésteres de forbol (EF), inviabiliza o aproveitamento do resíduo da extração de óleo na alimentação animal. As vias biossintéticas de tais compostos ainda não foram elucidadas, porém é conhecido que a enzima sintase do casbeno é comprometida com esta rota, sendo o seu produto o mais provável precursor dos EF. Em J. curcas a expressão de nenhum dos genes para a sintase do casbeno foi encontrada em sementes, mas sim em folhas e raízes, indicando que estes são os prováveis sítios de síntese de EF. Com objetivo de avaliar o envolvimento da sintase do casbeno na regulação da biossíntese e acúmulo de EF em sementes, dois genótipos com teor de EF contrastante foram comparados quanto à expressão relativa de genes para a sintase do casbeno em raiz e folha. Nove genes foram expressos em raiz e um também em folha, em ambos os genótipos. A expressão relativa de sintase do casbeno em folha foi cinco vezes superior para o genótipo com maior teor de ésteres de forbol, enquanto que em raiz não houve diferença significativa para a expressão relativa entre os genótipos. Essa diferença entre os níveis transcricionais de sintase da casbeno em folhas indica que essas provavelmente contribuem significativamente para a biossíntese e acúmulo de EF e que a atividade da sintase do casbeno na regulação da biossíntese de ésteres de forbol não é determinada transcricionalmente. Complementarmente, o presente trabalho avaliou a eficiência de diversos protocolos para hibridização in situ e PCR in situ em J. curcas com o intuito de contribuir para o desenvolvimento de técnicas de análise de expressão gênica in situ nesta espécie. No entanto, foram encontrados diversos obstáculos para a obtenção de resultados satisfatórios. Estas técnicas requerem muito tempo para serem otimizadas, pois todas as adaptações devem ser empiricamente testadas, o que torna o processo muito oneroso, e muitas vezes são restrita para tecidos e genes específicos