Mechanism of antifungal activity of tumor necrosis factor (TNF) against Candida albicans biofilm

Candida albicans is a polymorphic fungus and has as main virulence factor the biofilm formation,particularly, in prosthetic materials and host surfaces of immunosuppressed patients, causing life-threatening infections. Tumor necrosis factor (TNF) is a pleiotropic cytokine that has several functions in the defense mechanisms of the host, among which promote inflammation and, consequently, inhibit the growth of microorganisms. In protozoa, TNF can affect the growth of these through their lectin domains that are spatially distinct from TNF receptors. To our knowledge, a direct TNF effect on yeasts, which lack TNF receptors, has never been reported. Thus, the present study aims to demonstrate that TNF affects the in vitro growth of Candida albicans through a mechanism independent of the TNF receptor. For this, four strains biofilm producerCandida albicans(two strong producer and two weak producer) were cultured in the presence or absence of TNF solutions. Susceptibility to TNF was evaluated using the broth microdilution method. Biofilms were grown on 96-well microtitre plates and evaluated using XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)- 2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) assay, optical, confocal and scanning and transmission electron microscopy.Biochemical biofilm characteristics such as protein quantification and hydrophobicity index (HI) were also evaluated.Thus,it was observed thatTNF did not alter Candida albicans planktonic growth. However, TNF dose-dependently inhibited growing but not established biofilm development, virtually halting yeast filamentation. Preincubation with the TNF antibody adalimumab but not with the immunoglobulin G coupled TNF soluble receptor etanercept blocked TNF activity. Preincubation with the carbohydrate N,N’-diacetylchitobiose, a major component of the yeast cell wall, that binds to TNF lectin domain, abrogated TNF effect against Candida albicans growing biofilm. In conclusion, this is the first demonstration of a receptor independent TNF and no mammalian cells activity, on other words, direct effect against C. albicans biofilm growth. Blockade of TNF effect by N,N’-diacetylchitobiose suggests that it is mediated via the lectin domain of the cytokine.A Candida albicans é um fungo polimórfico que exprime como principal fator de virulência a formação de biofilmes, especialmente, em implantes médicos na superfícies de pacientes imunossuprimidos, causando infecções potencialmente fatais. O fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina pleitrópicaque denota diversas funções nos mecanismos de defesa do hospedeiro, dentre os quais promover a inflamação e, consequentemente, inibir o crescimento de microrganismos. Em protozoários, o TNF pode afetar o crescimento destes por meio dos seus domínios semelhante à lectina, espacialmente distintos dos receptores de TNF. No conhecimento que se tem, não há relatos de um efeito TNF direto em leveduras, que não possuem receptores de TNF. Assim, este trabalho objetivou demonstrar que o TNF afeta o crescimento in vitro de Candida albicanspor meio de um mecanismo independente do receptor de TNF. Para tal, quatro cepas de Candida albicans produtoras de biofilme (duas fortes e duas fracas formadoras) foram cultivadas na presença ou ausência de soluções de TNF. A susceptibilidade ao TNF foi avaliada utilizando o método de microdiluição em caldo. Os biofilmes foram cultivados em placas de 96 poços e avaliados empregando ensaio de redução de sal de XTT (2,3-Bis- (2-Metoxi-4-Nitro-5-Sulfofenil) -2H-Tetrazolium-5-Carboxanilida), microscopia óptica de campo claro, microscopia confocal e microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. Também foram avaliada características bioquímicas do biofilme, como quantificação de proteína e o índice de hidrofobicidade (IH). Assim, foi observado que o TNF não alterou o crescimento planctônico de Candida albicans. O TNF inibiu, contudo, de maneira dose-dependente, a formação de biofilme,por intermédio da modulação da transição de hifa-filamento. A pré-incubação com o anticorpo contra TNF, adalimumab, mas não com o receptor solúvel de TNF acoplado a imunoglobulina G, etanercept,causou um bloqueioda atividade do TNF. A pré-incubação com o carboidrato N, N'-Diacetilquitobiose, um dos principais componentes da parede celular da Candida albicans, que se liga ao domínio semelhante à lectina do TNF, bloqueou o efeito do TNF contra o crescimento de biofilme de Candida albicans.Em conclusão, esse é o primeiro trabalho que demosntra um efeito direto do TNFcontra a formação do biofilme de Candida albicans, ou seja, sem a participação de seus receptores clássicos ou células mamíferas. O bloqueio do efeito do TNF pela N, N'-diacetilquitobiose sugere que este efeito é mediado por meio de um domínio lectina da citocina