Biochemical characterization and biological activities of Calotropis procera laticifer chitinases

VIANA, Carolina de Araújo. Caracterização bioquímica e atividades biológicas de quitinases laticíferas de Calotropis procera. 2015. 181 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015.Calotropis procera is a latificer plant in the Apocynaceae family. Defensive proteins with activity against phytophagous insects and phytopathogenic fungi in latex have been described. Latex’s proteic fraction also performs pharmacological activities, such as selective cytotoxic effect in carcinogenic cells. From the proteic fraction effective against neoplastic cells, this work had the goal to identify and further characterize cytotoxic protein(s) biochemically, biologically, and evaluate their biotechnological prospects. Soluble proteins in latex (LP) have been fractioned in ion-exchange matrix, and the fraction capable of cytotoxicity was further fractioned in another ion-exchange matrix (Mono-Q) coupled to a medium-pressure system. P4 was identified as cytotoxic fraction, showing an IC50 of 2.2, 1.2 and 2.9 mg/mL for the cell lines HCT-116, Ovcar-8 and SF-295, respectively. Proteomic analysis of the cytotoxic fraction by two-dimensional electrophoresis allowed 15 spots to be identified, comprising acid proteins (pI among 4 and 6) with 30 kDa apparent molecular weight. All spots were identified as chitinases when evaluated by mass spectrometry, and showed intact mass of 27.4 kDa. The sample reacted positively to the Schiff reagent, suggesting glycosilations. The carbohydrate content was estimated at 12.8%. The amino-terminal sequence obtained (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revealed 50% similarity with Solanum lycopersicum, Oryza sativa and Nicotiana tomentosiformes chitinases, among others. The enzymes showed strong chitinolytic activity, with optimal pH varying between 5-6 and optimal temperature of 25 °C. The chitinolytic activity was diminished when treated with increasing concentrations of DTT (3, 10 and 30 mM), which suggests the presence of disulfide bonds stabilizing the enzyme. Circular dichroism analyses indicate a larger presence of alpha helices in the structure and that the isoforms has low resistance to pH and temperature variation. High-resolution images generated through atomic force microscopy suggested sample homogeneity and a hexameric configuration. The chitinases did not inhibit mycelial growth of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides, however reduced the germination C. gloeosporioides spores. In consonancy the chitinases did not induce spore oxidative stress, but caused a slight change in membrane permeability of the evaluated spores. Laticifer chitinases (0.1% w/w) showed a strong deleterious effect on the phytophagous insect Callosobruchus maculatus. Effects produced a 57% survival reduction, larval weight reduction (7.8 mg ± 0.2 / 4.0 ± 0.8), adult insets emergence reduction (50%), in addition to prolonging the mean maturation time from 28 to 33 days. The chitinases (2 mg/Kg, i.v.) showed a strong anti-inflammatory activity, reducing 95% of neutrophil infiltration into the peritoneal cavity in mouse in an inflammation induced by carrageenan assay. L-NAME and Aminoguanidine, two inhibitors of nitric oxide synthase, reversed this effect, possibly indicating involvement of nitric oxide in the effects observed. This action was associated to a reduction of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 levels within the peritoneal cavity and increased serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1. The conclusion is reached that many isoforms of chitinases coexist in C. procera latex. These proteins act possibly in defense against insects, though low action against fungi is shown. Laticifer chitinases were identified as latex proteins cytotoxic on neoplastic cells and they have even been able to modulate pro-inflammatory cytokines levels and nitric oxide in an acute inflammation model. C. procera laticifer chitinases represent interesting molecules for biotechnology prospection in plant defense and pharmacology.Calotropis procera é uma planta laticífera, pertencente à família Apocynaceae. Proteínas de defesa foram descritas no látex com atividade contra insetos fitófagos e fungos fitopatogênicos. A fração proteica do látex também apresenta atividades farmacológicas, dentre tais efeito citotóxico seletivo em células carcinogênicas. A partir da fração proteica efetiva sobre células neoplásicas, o trabalho teve por meta central identificar proteína(s) citotóxica(s) e proceder a sua caracterização bioquímica, biológica e suas perspectivas biotecnológicas. As proteínas solúveis do látex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iônica e a fração proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iônica (Mono-Q) acoplada a sistema de média pressão. P4 foi identificado como a fração citotóxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 µg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A análise proteômica da fração citotóxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteínas ácidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilações. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequência amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolítica, com pH ótimo variando entre 5-6 e temperatura ótima de 25 °C. A atividade quitinolítica foi reduzida quando tratada com concentrações crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presença de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. Análises por dicroísmo circular indicam a presença majoritária de alfa-hélices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variações de temperatura e pH. Imagens de alta resolução geradas por microscopia de força atômica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamérico foi evidenciado. As quitinases não inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinação de esporos de C. gloeosporioides. Em consonância as quitinases não induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alterações na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticíferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletério sobre o inseto fitófago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de redução na sobrevivência larval, redução do peso de larvas (7,8 mg ± 0,2 /4,0 ± 0,8) e emergência de insetos adultos (50%), além de prolongar de 28 para 33 dias o tempo médio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatória, reduzindo em 95% a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamação induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima óxido nítrico sintase, indicando o possível envolvimento do óxido nítrico no efeito observado. Esta ação foi associada à redução dos níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6 e IL-1. É concluído que várias isoformas de quitinases coexistem no látex de C. procera. Estas proteínas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas têm pouca ação contra fungos. As quitinases laticíferas foram identificadas como as proteínas citotóxicas do látex sobre células neoplásicas e ainda foram capazes de modular os níveis de citocinas pró-inflamatórias e síntese de óxido nítrico em modelo de inflamação aguda. As quitinases do látex de C. procera representam interessantes moléculas para prospecção biotecnológica em defesa vegetal e farmacologia