Production in Pichia pastoris of a chitinase from bean-string with antifungal activity

LANDIM, Patrícia Gadelha de Castro. Produção em Pichia pastoris de uma quitinase de feijão-de-corda com atividade antifúngica. 2011. 155 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011.Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50 ° C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41 ° C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity.As quitinases são enzimas capazes de hidrolisar as ligações β-(1,4)-glicosídicas presentes em biopolímeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarídeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterólogos e a proteína recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relação ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinação de esporos/conídios de fungos filamentosos. A seqüência de DNA codificando a proteína foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressão pET32a(+) e pPICZαA, para expressão heteróloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressão de rVuChi em células de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusão. Em seis estirpes de P. pastoris a proteína recombinante foi secretada, de forma solúvel, para o meio de cultura. Na fração extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolítica, após 72 horas de indução. A detecção de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protéicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequência N-terminal e a ausência de N-glicosilação foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fração F0/40 precipitada com sulfato de amônio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interações hidrofóbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltração em membrana com limite de exclusão de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolítica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora não tenha apresentado atividade contra substratos sintéticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusão molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis ‘spots’ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestável em temperaturas até 50 °C e sua atividade enzimática máxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presença de íons metálicos causou uma redução de sua atividade enzimática. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimática enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hélice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroísmo circular. A desnaturação de 50% das moléculas de rVuChi ocorreu a 54,41 °C. Os espectros de fluorescência revelaram que a proteína produzida em P. pastoris estava em sua conformação totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijão-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinação de esporos de Penicillium herquei até 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibição de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibição de 55% na germinação dos conídios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinação dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinação de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. Além disso, a proteína recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porém não apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata é uma proteína com atividade antifúngica