Effect direct nephrotoxic induced by L-aminoacid oxidase isolated of Bothrops leucurus venom

The pit viper Bothrops leucurus (White-tailed-jararaca) is a poisonous snake habituating area in the northeast of Brazil. The biological effects due envenomation have similar profile than those observed with other Bothrops, such as important severe local and systemic effects such as Acute Renal Failure (ARF). Bothrops leucurus venom induces nephrotoxicity in the isolated perfused kidney of rats associated with cytotoxicity against renal tubular epithelia cells. In this study, it was evaluated the direct nefrotoxicity of L-aminoacid oxidase isolated of B. leucurus venom (LAAO-Bl) on renal epithelial cells (MDCK and HK2) and their potential nephrotoxic in isolated rat kidney. In these cells treated with LAAO-Bl, 1.56 – 100 µg/mL for 12 h, there was a decrease in their viability in a concentration-dependent manner after 12 hours of treatment. In MDCK cells LDH release was not observed after 12 h of LAAO-Bl exposure while LAAO-Bl induced membrane rupture in HK-2 cells at the highest concentrations studied when compared with untreated cells. In MDCK cells, LAAO-Bl significantly increased the percentage of early apoptotic (Annexin-V+, PI-), necrotic (Annexin-V-, PI+) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) when compared with control untreated cells. In HK-2 cells LAAO-Bl induced an increase in necrotic (PI+ cells) and secondary necrotic cells (Annexin-V+, PI+) in a concentration-dependent manner. MDCK apoptosis induction was accompanied with Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, reactive oxygen species (ROS) generation, mitochondria dysfunction with enhanced expression of Bax protein levels. LAAO-Bl induced caspase-3 and caspase-7 activation in both cell lines. LAAO-Bl (10 µg/mL) exerts significant effects on the isolated kidney perfusion increasing perfusion pressure and urinary flow and decreasing the glomerular filtration rate and sodium, potassium and chloride tubular transport. Taken together our results suggest that LAAO-Bl contributes for the nephrotoxicity observed in the envenomation by Bothrops leucurus. Moreover, the cytotoxic of LAAO-Bl to renal epithelial cells might be responsible, least in part for the nephrotoxicity observed in isolated kidney.A Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco) é uma serpente peçonhenta que habita a região Nordeste do Brasil. Os efeitos biológicos devido ao envenenamento por B. leucurus têm perfil semelhante àqueles apresentados por outras serpentes do gênero Bothrops, tais como, importantes efeitos locais e sistêmicos graves como a Insuficiência Renal Aguda (IRA). O veneno de Bothrops leucurus induziu nefrotoxicidade em sistema de perfusão de rim isolado de rato, associado com citotoxicidade em células tubulares epiteliais renais. Neste trabalho foi avaliado o efeito nefrotóxico direto da enzima L-aminoácido oxidase isolada do veneno de Bothrops leucurus (LAAO-Bl) sobre células epiteliais renais (MDCK e HK2) e o seu potencial nefrotóxico em rim isolado de rato. O tratamento com LAAO-Bl, 1.56 – 100 µg/mL induziu significativa morte celular de maneira concentração dependente em ambas às linhagens celulares após 12 horas de tratamento. Nas células MDCK não foi observada liberação de LDH após 12 horas de exposição à LAAO-Bl, enquanto nas células HK2 LAAO-Bl induziu ruptura de membrana nas maiores concentrações estudadas quando comparado ao controle não tratado. Nas células MDCK o tratamento com LAAO-Bl aumentou significativamente a porcentagem de células em apoptose (Anexina-V+, IP-), necrose (Anexina-V-, IP+) e necrose secundária (Anexina-V+, IP+). Nas células HK2 LAAO-Bl induziu um aumento na porcentagem de células em necrose (IP+) e necrose secundária (Anexina-V+, IP+) de maneira concentração dependente. A indução de apoptose nas células MDCK foi acompanhada de liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático, aumento de espécies reativas de oxigênio, disfunção mitocondrial e aumento de expressão de Bax. O tratamento com LAAO-Bl induziu ativação de caspase 3 e 7 em ambas as linhagens celulares. LAAO-Bl (10 µg/mL) exerce efeitos significativos no rim isolado de rato aumentando a pressão de perfusão e o fluxo urinário e diminuindo a taxa de filtração glomerular e os transportes tubulares de sódio, potássio e cloreto. Os nossos resultados sugerem que LAAO-Bl contribui para nefrotoxicidade observada no envenenamento por Bothorps leucurus. Além disso, os efeitos citotóxicos de LAAO-Bl nas células epiteliais renais podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pela nefrotoxicidade observada no rim isolado