Molecular and biological characterization of a begomovirus isolated from tomato, Lycopersicon esculentum Mill. in the state of Goiás and its interaction with the vector Bemisia argentifolii Bellows & Perring.

SANTOS, C. D. G. Caracterização molecular e biológica de um begomovírus isolado de tomateiro, Lycopersicon esculentum Mill., no estado de Goiás e sua interação com o vetor Bemisia argentifolii Bellows & Perring. 2001. 174 f. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitotecnia) - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2001.The whitefly-transmitted viruses from the family Geminiviridae, genus Begomovirus, have been reported as an economically important pathogen group that affect important crops in tropical and subtropical countries. Since the beginning of the 1980 decade, the occurrence of the whitefly associated to Begomovirus infection has drastically increased worldwide. In Brazil, these pathogens have been responsable for severe economical losses in tomato (Lycopersicon esculentum) orchards and the production has hampered since 1994. In this work, infected tomato plants showing symptoms, such as mosaic, intervein clearing, leaf curling and growth reduction were collected in tomato orchards in Anápolis, State of Goiás. The virus was identified as a member of the genus Begomovirus by PCR reaction, using specific primers to amplify fragments of A and B components of the virus DNA genome. The Chapter I of this thesis presents the results of the molecular characterization of the virus and the Chapter II shows the determination of its host range and the relationship with its natural vector Bemisia argentifolii. The virus isolate denoted GO-ANPL was cloned and partially sequenced. Part of the sequenced genome (2.180 nucleotides long) corresponded to the coat protein and Rep genes and comprised the entire intergenic region. Sequence comparison revealed that the GO-ANPL isolate is distantly related to the begomoviruses found in Asia, Europe and Africa, and it is related to other begomoviruses reported in Brazil. The virus isolate showed to be more closely related to viruses found in the State of Minas Gerais (TRMV isolate) and in the Federal District (isolate DF-Br2). The highest homology was observed with the isolate DF-Br2 and it may represent a new specie of the genus Begomovirus. In order to determine the virus host range, 46 plant species from nine different botanical families were mechanically and using the virus vector inoculated. The GO-ANPL isolate preferentially infected plants of the family Solanaceae as Nicotiana benthamiana, Datura stramonium and Nicandra physalodes. The number of infected plants was higher when they were inoculated by the virus vector, and the results were distinct from those obtained for other begomoviruses reported in Brazil. Viruses infections were all confirmed by dot blot hybridization using specific molecular probes to the virus. 4 To study virus/vector interaction, the acquisition access period (AAP), inoculation access period (IAP), and the latent period were determined transfering five whiteflies per plant and using tomato cv. Santa Clara as the host. For the AAP and IAP, nine different time periods were tested: 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 20 and 24 h. The minimal AAP determined was 0.25 h, after which, 6% of the tested plants became infected. The number of infected plants increased to 65% with an AAP of24h.Afteran IAP of 0.5 h, 18% of the plants were infected and their number increased to 67% after an IAP of 24 hours. The latent period was considered to be 16 h, after which, 3% of the inoculated plants became infected. The results of AAP, IAP and latent period seem to indicate an early interaction between virus and vector starting at early stages of vector development. The presence of the GOANPL was determined in all stages of the vector (eggs, 1st to 4th instar and adults) in infected plants, in adults under different AAPs, in the progenies of viruliferous females, and in adults originated from nymphs developed from infected plants. More than 2.500 insects were tested by PCR to detect the GO-ANPL isolate. The virus was detected in nymphs from the 1st to 4th instar that had fed in infected plants and no virus was found in eggs from aviruliferous female that had been laid in infected plants. Transmission to the progenies was observed, since the virus was detected in all stages of insect development from eggs to adults. High level transmission was also observed in newly emerged adults that had acess to virus-infected plants as immatures. This fact, in addition to the transmission to the progenies, suggests that virus retention is an important part of virus/vector interaction. No transmission was observed from adults originated from viruliferous females. However, 33% of virus transmission was obtained when adults that retained virus from their early larval stages were employed. 2001.Os begomovírus, vírus da família Geminiviridae transmitidos por mosca branca, têm emergido como sérios patógenos de culturas agronômicas e hortícolas em regiões tropicais e subtropicais de muitos países em todo o mundo. A partir da década de 80, têm aumentado os relatos da disseminação da mosca branca, Bemisia argentifolii, e de begomovírus provocando impacto devastador nas regiões em que ocorrem. No Brasil, estes patógenos têm sido limitantes para a produção de tomate (Lycopersicon esculentum) em várias áreas de cultivo com incidência crescente desde 1994. No presente trabalho, plantas de tomate exibindo sintomas de infecção provocada por vírus como mosaico, clorose internerval, enrolamento do limbo foliar e redução do crescimento, foram coletadas em lavouras de tomate indústria em Anápolis-GO. O vírus foi identificado como pertencente ao gênero Begomovirus mediante técnica de PCR usando oligonucleotídeos específicos que amplificaram fragmentos dos componentes A e B do genoma viral. No capítulo I são apresentados os resultados da caracterização molecular e no capítulo II, os dados da determinação do círculo de hospedeiros e da investigação da relação do begomovírus com o vetor Bemisia argentifolii. O isolado denominado GOANPL, foi clonado e parcialmente seqüenciado tendo sido obtidas as seqüências nucleotídicas dos genes da capa proteica, Rep e de toda a região intergênica, em um total de 2.130 nucleotídeos. A análise comparativa das seqüências revelou que, em geral, o GOANPL possui relacionamento genético distante com begomovírus da Ásia, Europa e África sendo mais próximo das espécies do Brasil, particularmente, com os begomovírus identificados em Minas Gerais (TRMV) e no Distrito Federal (DF-BR2). Com este último, apresentou alta homologia em todo o genoma podendo vir a constituir, com o mesmo, uma nova espécie. A determinação do círculo de hospedeiros do GO-ANPL foi realizada inoculando-se 46 espécies vegetais pertencentes a nove famílias botânicas, sob duas modalidades de inoculação: mecânica e com a mosca branca. Constatou-se que o GO-ANPL infecta, preferencialmente, plantas da família Solanaceae como Nicotiana benthamiana, Datura stramonium e Nicandra physalodes. O número de espécies infectadas com o inseto vetor foi superior ao obtido pela inoculação mecânica e diferiu dos resultados obtidos para outros isolados de begomovírus de tomate no Brasil. Os testes foram todos confirmados com hibridização com sondas moleculares, em \"dot blot\"No estudo da relação vírus-vetor, foram investigados o período de acesso de aquisição do vírus (PAA), o período de acesso de inoculação do vírus (PAI), e o período de latência do vírus na fase adulta do vetor, empregando-se cinco moscas/planta de tomate \'Santa Clara\' em todos os tratamentos. Para a definição do PAA e do PAI, foram testados nove diferentes períodos de tempo: 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 20 e 24 horas. Nos testes para determinação do PAA, após cada um desses períodos seguiu-se uma inoculação de 48 horas e para definição do PAI, antes de cada período antecedeu-se um período de acesso de aquisição fixo de 72 horas. Constatou-se que o PAA mínimo da mosca branca foi de apenas 0,25 hora, com o qual foram obtidas 6% de plantas infectadas. O percentual de plantas aumentou de 6 para 65% com a extensão do PAA de 0,25 para 24 horas. Com relação ao período de acesso de inoculação do vírus, foram registrados 18% de plantas infectadas com o PAI de 0,5 hora. O percentual elevou-se para 67% quando 24 horas de PAI foram concedidos. Valores isolados de 90 e 100% na transmissão viral, também foram observados. O término do período latente do vírus no vetor ocorreu 16h após a aquisição do mesmo em planta infectada, considerando os 3% de infecção observados nas plantas inoculadas. Os dados obtidos indicam que a interação vírus-vetor é estabelecida desde a fase inicial de desenvolvimento do inseto. Como parte do estudo dessa interação, avaliou-se a presença do begomovírus GO-ANPL em todas as fases de desenvolvimento do inseto vetor (ovo, 1º ao 4º ínstar e adulto) na planta infectada, em adultos com diferentes PAA, na progênie de fêmeas virulíferas e em adultos cujos estágios ninfais desenvolveram-se em tomateiro infectado. A técnica PCR foi empregada para a detecção do GO-ANPL em mais de 2.500 espécimens testados. O vírus foi detectado em ninfas do 1º ao 4º ínstar que se alimentaram em plantas de tomate infectada, contudo, em ovos provenientes de avirulíferas, os quais foram ovipositados em planta infectada e coletados após sete dias, o vírus não foi detectado. A transmissão à progênie foi constatada pela detecção do vírus em ovos, ninfas e adultos que se desenvolveram em planta não hospedeira do vírus. A transmissão transestadial ocorreu com índice elevado e, ao lado da transmissão à progênie, indica que a retenção do vírus é uma etapa importante da interação vírus–vetor. A transmissão do vírus para mudas de tomate, a partir de adultos da progênie de fêmeas virulíferas, não foi constatada. Contudo, transmissão para tomateiro em um percentual de 33% foi verificado nos casos em que a inoculação das plantas foi realizada pelos adultos que retiveram o vírus da sua fase imatura (transestadial)