Detecção da proteína Kin e RNAs Y em células e tumores de melanoma de camundongo

Orientador: Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida FernandezTese (doutorado em Ciências Biológicas)--Universidade Estadual de Maringá, 2018Resumo: Melanoma é a forma mais agressiva de câncer de pele. Por ser uma doença muito variável ao nível molecular, sendo que a detecção e o tratamento do melanoma, podem ser considerados um dos principais desafios na área da oncologia, com centenas de diagnósticos e terapias. A transformação dos melanócitos em células de melanomas é um processo de muitas etapas e com vários mecanismos possíveis, sendo um ponto chave para a compreensão desta doença. As proteínas que estão associadas com o reparo do DNA estão entre os alvos favoritos dos estudos com tumores malignos, e entre elas está a proteína KIN (kin17). Descrita como provável envolvida nos processos de iniciação de replicação, recombinação e reparo do DNA em mamíferos, e pode ser ativada pelo stress provocado por radiação gama ou irradiação com UVC. Comparando a proteína KIN entre murinos e humanos, apresenta homologia de 92,4%, contendo 391 e 393 aminoácidos e massa molecular de 45 e 47 kDa, respectivamente e mesmo ponto isoelétrico teórico 9,3. A sua estrutura consiste em um domínio dedo de zinco, que confere afinidade à ácidos nucleicos; um domínio hélice alada, que é um mediador de interação com DNA e colabora com a interação proteína-proteina; um domínio de homologia de 15 aminoácidos com proteína RecA bacteriana; um sinal de localização nuclear; um motivo KOW na extremidade C-terminal, que está relacionada com interação RNA-proteína. A proteína KIN é descrita como superexpressa em vários tipos de câncer, sendo estudada como um potencial biomarcador para diagnóstico de câncer de mama e marcador para resposta a quimioterapia em câncer colorretal. Estudos mais aprofundados estão sendo realizados para determinar se essa proteína pode ser associada como potencial marcador para outros tipos de canceres. Como em células de melanoma ainda não há relatos da expressão da proteína KIN, o objetivo do primeiro artigo foi confirmar se as linhagens de melanomas tinham o potencial metastático e não metastático e se havia expressão diferencial entre os tipos celulares. Foi observado que as linhagens de melanoma derivadas da B16F10-Nex2 por diluição limitante, a B16-8HR ao injetada intravenosamente, formam mais nódulos nos pulmões do que a B16-10CR, caracterizando esta linhagem como metastática. Já quando as células são injetadas subcutâneamente, a linhagem B16-10CR, forma tumores subcutâneos, caracterizando como linhagem não-metastática. Com relação a localização da KIN, em todas as linhagens a KIN foi detectada no núcleo, não havendo diferença significativa de intensidade de detecção. Analisamos, por western blot se havia diferença de detecção da KIN de acordo com a fração proteica extraída das células. Na fração nuclear, quase não houve diferença de detecção da KIN entre as linhagens. Já na fração associada a cromatina houve uma maior detecção na linhagem B16-10CR (não-metastática). Neste trabalho, pudemos observar que há uma diferença de detecção da KIN entre as linhagens metastática e não-metastática, indicando uma diferenciação entre elas o que pode colaborar futuramente com estudos mais aprofundados em um indicador não invasivo de diagnóstico de melanomas. Uma classe complexa em sua estrutura e função de ácidos nucleicos são RNAs não codificantes (ncRNAs), embora sejam uma classe de RNAs que não sejam traduzidos, são altamente transcritos e são responsáveis por diferentes funções celulares. Esses tipos de RNAs são classificados como pequenos (sncRNAs) possuindo menos de 400 nucleotídeos. Neste grupo estão contidos os pequenos RNAs de interferência (siRNAs), Piwi-RNAs de interação e ligação (piRNAs) e os RNAs Y. A principal função celular associada aos RNAs Y é o envolvimento no processo de iniciação da replicação do DNA. Os mecanismos envolvidos na participação destes RNAs na iniciação da replicação do DNA em vertebrados ainda não são estabelecidos, embora a interação dessas moléculas com proteínas envolvidas na replicação tenha sido relatada. Como os RNAs Y são descritos como envolvidos na replicação do DNA e a proteína KIN é descrita como super expressa em tecidos tumorais, o objetivo do segundo trabalho foi detectar proteína KIN e RNAs Y em tumores de melanoma de camundongo, se ambos estão superexpressos nos tecidos estudados e se há diferenças entre os tumores metastáticos e não metastáticos. Para analisar essas alterações foram usadas as técnicas de qPCR para células em cultura, para as amostras de tumores de camundongos qPCR e western blot. A linhagem EJ30 (carcinoma de bexiga humano) já bem estabelecida na análise dos RNAs Y, foi utilizada como padrão de expressão. Na linhagem metastática (B16-8HR) a expressão da proteína KIN foi maior, comparada com as outras linhagens de melanoma. Comparando com a EJ30 ambas tiveram expressão bem semelhante. Os RNAs Y analisados foram o 1 e 3, para ambos a linhagem B1610-CR (não-metastática) teve a maior expressão entre os melanomas e similar a EJ30. Na análise de qPCR dos tecidos, a expressão da KIN entre as linhagens metastática e não-metastática foi bem parecida. Com relação aos RNAs Y, os tecidos injetados com a linhagem B16-10CR apresentaram a maior expressão tanto do RNA Y1 como de Y3. Na análise por western blot dos tecidos, a detecção da proteína KIN, foi semelhante entre os tecidos injetados com as células B16-8HR e B16-10CR, não havendo diferença com relação ao controle. A imunolocalização objetivou complementar o que foi observado anteriormente e confirmar se a KIN se localiza próxima a regiões de ribogênese, como relatados em outros trabalhos do nosso grupo. Detectamos a KIN e a proteína fibrilarina que é um marcador de nucléolo e observamos que nas linhagens, são observados os acúmulos da proteína KIN eles estão próximos a regiões nucleolares. Nossos resultados confirmaram estudos anteriores que descreveram sobre a proteína KIN em melanoma e outros tipos de câncer e que esta proteína é mais expressa em células tumorais e tumores. Além disso, a acumulação de KIN ocorre próximo às proteínas relacionadas ao nucléolo. No que diz respeito aos RNAs Y, eles são mais expressos em células que têm grande intensidade de divisão celular. Nos tecidos injetados com as células B16-8HR e B16-10CR, não houve diferença significativa de quantidade e de tipo de RNA Y. Estudos adicionais devem ser realizados para confirmar a relação da presença de RNAs Y nos tumores de melanoma. Estudos adicionais devem ser realizados com células e tumores de melanoma humano para confirmar se a proteína KIN e os RNAs Y podem estar associados ao fenótipo tumoralAbstract: Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. It being a very variable disease at the molecular level. The detection and treatment of melanoma can be considered a major challenge in oncology with hundreds of diagnoses and therapies. The transformation of melanocytes into melanoma cells is a multi-step process with several possible mechanisms, being a key point for understanding this disease. Proteins associated with DNA repair are among the favorite targets of studies with malignant tumors, including KIN protein (kin17). Described as putative in the processes of initiation of replication, recombination and DNA repair in mammals, it can be activated by the stress caused by gamma radiation or irradiation with UVC. Comparing KIN protein between murine and human, it has a homology of 92.4%, containing 391 and 393 amino acids and molecular mass of 45 and 47 kDa, respectively, and the same theoretical isoelectric point 9,3. Its structure consisted of a zinc finger domain, which imparts affinity to nucleic acids; a winged helix domain, which is a mediator of DNA interaction and collaborates with the protein-protein interaction; a 15 amino acids homology domain with bacterial RecA protein; a nuclear localization signal; a KOW motif at the C-terminus, which is related to RNA-protein interaction. The KIN protein is described as overexpressed in various cancers, being studied with a potential biomarker for diagnosis of breast cancer, a marker for response to chemotherapy in colorectal cancer. More in-depth studies are underway to determine whether this protein may be associated as a potential marker for other cancers. As in melanoma cells there are still no reports of KIN protein expression, the aim of the first article was to confirm whether melanoma cell lines had metastatic and non-metastatic potential and whether there was differential expression between cell types. In B16F10-Nex2-derived cell lines by limiting dilution, the B16-8HR when injected intravenously, form more nodules in the lungs than B16-10CR, characterizing this lineage as metastatic. When the cells are injected subcutaneously, the lineage B16-10CR, forms subcutaneous tumors, characterizing as non-metastatic lineage. Regarding the location of KIN, in all strains analyzed, KIN was detected in the nucleus, with no significant difference in detection intensity. We analyzed whether there was difference in detection of KIN according to the protein fraction extracted from the cells by Western blot. In the nuclear fraction, there was no difference in KIN detection between the cell lines. In the associated chromatin fraction, there was a greater detection in the B16-10CR (non-metastatic). In this work, we can observe that there is a difference in detection of KIN between the metastatic and non-metastatic cell lines, which may collaborate in the future with further studies on a noninvasive indicator of diagnosis of melanomas. A complex class in its structure and function of nucleic acids are non-coding RNAs (ncRNAs), although they are a class of RNAs that are not translated, are highly transcribed and are responsible for different cellular functions. These types of RNAs are classified as small RNAs (sncRNAs) having fewer than 400 nucleotides, and they are the small interfering RNAs (siRNAs), Piwi-RNAs of interaction and binding (piRNAs) and the YRNAs. The main cellular function associated with YRNAs is its involvement in the process of initiation of DNA replication. The mechanisms involved in the participation of these RNAs in the activation of DNA replication in vertebrates are not well understood yet, although the interaction of these molecules with proteins involved in replication has been reported. As YRNAs are described as involved in DNA replication and KIN protein is described as super expressed in tumor tissues, the aim of the second work was to detect KIN protein and YRNAs in mouse melanoma tumor, if both are overexpressed in tissues studied and whether there are differences between metastatic and non-metastatic tumor. To analyze these differences, qPCR techniques were used for cells culture, for mouse tumors samples qPCR and Western blot. The EJ30 cell line (human bladder carcinoma), already well established in the analysis of YRNAs, was used as the expression standard. In the metastatic line (B16-8HR) the expression of KIN protein was higher, compared to the other melanoma lines, however, compared to EJ30, both had very similar expression. The YRNAs analyzed were 1 and 3, and B16-10CR (non-metastatic) had the highest expression among melanomas and like EJ30. In the tissue qPCR analysis, KIN expression between metastatic and non-metastatic lines was very similar. The Y RNAs in the tissues injected with B16-10CR had the highest expression of both Y1 and Y3 RNA. In the tissues analyzed by Western blot, the detection of the KIN protein was very similar between the tissues injected with the B16-8HR and B16-10CR cells, with no difference in relation to the control. The immunolocalization complemented the previous work and to confirm if the KIN is located near regions of ribosome biogenesis, as reported in other works of our group. We detected KIN and the fibrillarin protein which is a nucleolus marker and we observed that in the lines that are observed the KIN protein accumulations are close to nucleolar regions. Our results confirmed what previous studies have described on KIN protein in melanoma and other cancers, that this protein is more expressed in tumor cells and tumors. In addition, KIN accumulation is close to nucleolus-related proteins. With respect to Y RNAs, they are more expressed in cells that have high intensity of cell division. In tissues injected with B16-8HR and B16-10CR cells, there was no significant difference in amount and type of RNA Y. Additional studies should be performed to confirm the relationship of the presence of YRNAs in melanoma tumor. Further studies should be performed with human melanoma cells and tumors to confirm whether KIN protein and Y RNAs may be associated with the tumor phenotyp