Diversity and symbiotic efficiency of rhizobial strains isolated from nodules of wood-queen (Centrolobium paraense Tul.)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorCentrolobium paraense Tul. conhecida popularmente como pau-rainha é uma leguminosa arbórea que ocorre em ilhas de mata, florestas de transição e matas de galerias das savanas de Roraima. Esta leguminosa se beneficia do processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) através da simbiose com bactérias do grupo rizóbio. No entanto, pouco se sabe sobre a diversidade e a eficiência dessas bactérias em simbiose com pau-rainha. Este estudo teve como objetivo a caracterização de rizóbios associados às raízes de pau-rainha em Roraima, bem como a avaliação da eficiência simbiótica na promoção do crescimento de mudas através da FBN. Para isso, plantas de pau-rainha foram cultivadas em solos coletados em ilhas de mata localizadas nos municípios de Mucajaí, Bonfim, Boa Vista e Normandia para obtenção dos nódulos, e posterior isolamento das bactérias em meio de cultura. As bactérias foram caracterizadas morfologicamente e agrupadas de acordo com os perfis gerados. Representantes de cada grupo foram avaliados quanto à capacidade de nodulação utilizando o feijão-caupi como planta hospedeira. Os que apresentaram resultados positivos foram caracterizados geneticamente através da técnica de BOX-PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. Em seguida uma nova autenticação foi realizada, e os isolados que repetiram os resultados anteriores ou apresentaram similaridade com espécies reconhecidamente nodulíferas foram selecionados para teste de eficiência em pau-rainha. Para avaliar a eficiência da FBN, os rizóbios foram utilizados na inoculação de plântulas de pau-rainha sob condições estéreis de casa de vegetação durante 100 dias, procedendo à análise estatística para os parâmetros: nitrogênio total, massa seca da parte aérea, área foliar, massa seca de raiz, número de folíolos, altura da planta, diâmetro do caule, massa seca de nódulos e número de nódulos. Os identificados como Bradyrhizobium foram avaliados através do sequenciamento de cinco genesglnII, gyrB, rpoB, recA e dnaKpara análise de sequência multilocus (MLSA). De um total de 355 nódulos coletados, foram obtidos 178 isolados, sendo a maioria de crescimento lento com capacidade de alcalinizar o meio de cultura, compatíveis com o gênero Bradyrhizobium. A partir da caracterização morfológica foi gerado um dendrograma onde se constatou a formação de nove grupos com perfis distintos. Quarenta isolados foram selecionados para a autenticação e trinta e seis foram capazes de induzir a nodulação. A análise do BOX-PCR revelou-se que estes isolados apresentam pouca semelhança entre eles. No entanto a análise do sequenciamento do gene 16S rRNA, revelou que a maioria dos isolados pertenciam ao gênero Bradyrhizobium. Estes confirmaram a capacidade de nodulação e foram selecionados para ensaio de eficiência em pau-rainha juntamente com quatro isolados identificados comoRhizobium tropici e Pleomorphomonas oryzae. Os isolados pertencentes ao gênero Bradyrhizobium foram os mais eficientes, com destaque para os isolados ERR 326, ERR 399 e ERR 435 que proporcionaram os melhores resultados em todas as avaliações. A partir da MLSA ficou evidenciado que os isolados apresentaram grandes divergências com as estirpes de referência de Bradyrhizobium, indicando haver espécies novas colonizando o pau-rainha.Centrolobium paraense Tul. popularly known as wood-queen is a leguminous tree that occurs in islands of forest, transition forest and gallery forests of Roraima savannas. This legume benefits from the process of biological nitrogen fixation (BNF) through symbiosis with rhizobia bacteria group. However, little is known about the diversity and efficiency of these bacteria in symbiosis with wood-queen. This study aimed to characterize rhizobia associated with the roots of wood-queen in Roraima, as well as evaluating the symbiotic effectiveness in promoting the growth of seedlings by FBN. For this, plants of wood-queen were grown in soils collected in forest islands located in the municipalities of Mucajaí, Bonfim, Boa Vista and Normandia to obtain the nodules, and subsequent isolation of bacteria in culture medium. The bacteria were morphologically characterized and grouped according to the profiles generated. Representatives of each group were evaluated for nodulation using cowpea as host plant, and those who tested positive were genetically characterized using the technique of BOX-PCR and partial sequencing of the 16S rRNA. Then a new authentication was performed, and that the isolated or repeated previous results showed similarity with known nodulating species were selected to test efficiency in wood-queen. To evaluate the efficiency of BNF, the strains were used to inoculate seedlings wood-queen under sterile conditions in a greenhouse for 100 days, carrying out statistical analysis for theparameters: total nitrogen, shoot dry weight, leaf area, root dry weight, number of leaves, plant height, stem diameter, dry mass and number of nodes. Those identified as Bradyrhizobium were evaluated by sequencing five genes glnII, gyrB, rpoB, recA and dnaK for multilocus sequence analysis (MLSA). From a total of 355 nodes collected were obtained 178 isolates, most slow growing with capacity to alkalinize the culture medium, compatible with the genus Bradyrhizobium. From the morphological characterization of a dendrogram was generated which demonstrated the formation of nine groups with distinct profiles. Forty isolates were selected for authentication and thirty six were able to induce nodulation. A BOX-PCR analysis revealed that these isolates show little similarity between them. However the analysis of 16S rRNA gene sequencing revealed that most isolates belonged to the genus Bradyrhizobium. These confirmed the nodulation and were selected for assay efficiency wood queen with four isolates identified as Rhizobium tropici and Pleomorphomonas oryzae. The isolates belonging to the genus Bradyrhizobium were the most efficient, especially for isolates ERR 326, ERR 399 and ERR 435 that provided the best results in all evaluations. From the MLSA was evident that the isolates showed large differences with the reference strains of Bradyrhizobium, indicating a new species colonizing the wood-queen