Quantum Dots como nanoplataformas funcionais para estudo da dinâmica de receptores de ácido fólico e do perfil de ácido siálico em membranas celulares

CAPESAs membranas celulares possuem estruturas que desempenham complexas atividades, dentre elas estão os receptores de folato (RFs) e os ácidos siálicos (ASs). Os RFs são responsáveis por internalizar uma vitamina essencial para o organismo, o ácido fólico (AF). Já os ASs conferem carga eletronegativa à superfície celular, a qual intermedia processos como migração e adesão celular. Assim, o uso de ferramentas versáteis e sensíveis, como os quantum dots (QDs), capazes de monitorar alterações nesse receptor e nesse carboidrato pode fornecer dados para a compreensão de vários processos biológicos, como os associados ao câncer. QDs são nanocristais fluorescentes de semicondutores que apresentam propriedades singulares, tais como uma superfície ativa para conjugação a moléculas e alta fotoestabilidade. Sendo assim, esse trabalho teve como objetivo estudar a dinâmica dos RFs e o perfil de ASs nas membranas celulares através do uso de QDs. Em um primeiro trabalho, os QDs foram conjugados ao AF (QDs-AF) para estudar a expressão / internalização e reciclagem dos RFs nas células T47D, MDA-MB231 e MCF7, utilizando a HeLa como controle. A técnica de espectroscopia de correlação por fluorescência (FCS) comprovou a efetividade dessa conjugação. Também foi realizado um ensaio de saturação dos RFs, pelo qual se comprovou a especificidade do conjugado e assim também foi possível inferir sobre a taxa de reciclagem desses receptores nessas células. Os ensaios de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo indicaram que as células HeLa e T47D expressaram/internalizaram níveis mais altos de RFs (95% e 90% de marcação) do que a MDA-MB231 (68%). Já a MCF7 apresentou um baixo número de RFs funcionais (3%). Nos ensaios de saturação foi observado que a taxa de reciclagem do RF é baixa (6%, 4%, 2% de marcação para HeLa, MDA-MB231 e MCF7), exceto para T47D (26%). Em um segundo estudo, os QDs foram conjugados ao ácido 3-mercaptofenilborônico (QDs-AMFB) e eritrócitos foram utilizados como modelo para avaliar essas nanossondas. Os ácidos fenilborônicos vêm sendo chamados de lectinas miméticas, por também se ligarem reversivelmente a vários tipos de carboidratos. O FCS também comprovou a conjugação. A especificidade do conjugado pelo AS foi provada ao observarmos uma redução da marcação por citometria de fluxo quando os eritrócitos foram tratados previamente com sialidase, uma enzima que retira o AS, bem como por ensaios de inibição com outros carboidratos. As análises de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência indicaram que praticamente todos os eritrócitos foram marcadas de forma específica pelo conjugado QDs-AMFB. Após essa etapa foram realizados ensaios fluorescentes com linhagens de leucemia mielóide aguda e crônica KG-1 e K562 e os resultados citométricos obtidos até então indicam que as membranas das células KG-1 possuem maior quantidade de AS, 99% de marcação e uma mediana de intensidade de fluorescência cerca de 2x maior quando comparada a K562 (marcação de 84%). Dessa forma podemos concluir que nesse estudo foram desenvolvidos conjugados de QDs-AF e QDs-AMFB eficientes, os quais auxiliaram a agregar informações para a compreensão da biologia celular do câncer e seus processos, possibilitando assim abrir novas frentes no diagnóstico/terapia desta doença.Cell membranes have structures that perform complex activities. Among them, there are the folate receptors (FRs) and sialic acids (SAs). FRs are responsible for internalizing an essential vitamin for the human body, folic acid (FA). SAs confer electronegative charges to cell membranes, which mediate processes such as migration and cell adhesion. Thus, the use of versatile and sensitive tools, such as quantum dots (QDs), capable of monitoring changes in FRs and ASs can provide valuable data for understanding several biological processes, such as those associated with cancer. QDs are fluorescent nanocrystals made of semiconductor materials that exhibit unique properties, such as an active surface for conjugation with molecules and high photostability. Therefore, this work had as objective to study both the dynamics of FRs and the profile of SA in cell membranes applying QDs. In the first work, QDs were conjugated to FA (QDs-FA) to study the expression/internalization and recycling of FRs in T47D, MDA-MB231 and MCF7 cells, using HeLa as a control. The fluorescence correlation spectroscopy (FCS) technique confirmed the effectiveness of this conjugation. An FR saturation assay was also performed, which not only proved the specificity of the conjugate but also allowed us to analyze the recycling rate of those receptors in these cells. Fluorescence and flow cytometry microscopy assays indicated that HeLa and T47D cells expressed/internalized higher levels of FRs (95% and 90% of labeling were found) than MDA-MB231 (68%). MCF7 seems to have a low number of functional FRs (3%). In the saturation tests, it was observed that the recycling rate of FRs is low (6%, 4%, 2% of labeling for HeLa, MDA-MB231, and MCF7), except for T47D (26%). In a second study, QDs were conjugated to 3-mercaptophenylboronic acid (QDs-AMPB), and erythrocytes were used as models to develop those nanoprobes. Phenylboronic acids have been called mimetic lectins because they are also able to bind reversibly to various types of carbohydrates. The FCS also confirmed the conjugation. The specificity of the SA conjugate was proved by observing a reduction in the flow cytometric labeling when erythrocytes were pretreated with sialidase, a SA-removing enzyme, as well as by inhibition assays with other carbohydrates. Flow cytometry and fluorescence microscopy analyses indicated that practically all erythrocytes were specifically labeled by QDs-AMPB. After this step, fluorescence assays were performed with acute and chronic myelogenous leukemia cell lines (KG-1 and K562), and flow cytometry results obtained until the moment indicated that KG-1 membranes presented greater amount of SA, 99% of labeling with a median of fluorescence intensity ca. 2x higher, when compared to K562 (84% of labeling). In this way, we can conclude that in this study, efficient QDs-FA and QDs-AMPB conjugates were developed, providing information for understanding the cell biology of cancer and its processes, thus opening new perspectives to the diagnosis/therapy of this disease