Clonagem molecular e expressão em Pichia pastoris do gene L1 de papilomavírus bovino tipo 2

Os papilomavírus são um grupo de pequenos vírus DNA dupla fita caracterizado por induzir a formação de lesões que, normalmente, são benignas e podem regredir naturalmente, mas também apresentam opotencial para se tornarem tumores malignos. O papilomavírus humano (HPV) está fortemente relacionado às doenças sexualmente transmissíveis (DST) e é uma das principais causas de câncer cervical. O papilomavírus bovino (BPV), por sua vez, representa um grave problema econômico em termos de pecuária. Em bovinos, são mais comuns as papilomatosescutânease mucosas nas regiões genital e orofaríngea. Existem bem caracterizados seis tipos diferentes de BPV (BPV 1 ao 6) e, recentemente, quatro novos tipos (BPVs 7 ao 10) foram seqüenciados. No Nordeste, especialmente no estado de Pernambuco (Zona da Mata), a incidência da papilomatose bovina é muito alta, causando grandes perdas econômicas para os criadores. Não há tratamento com eficácia comprovada. Proteção contra a infecção é conferida por anticorpos neutralizantes dirigidos contra osepítopos conformacionais de proteínas estruturais L1. Esses anticorpos podem ser eficientemente induzidos pela imunização com virus-like particles(VLP) que se formam espontaneamente, após a expressão de L1 em sistemas heterólogos. Nos últimos anos, a levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema eficaz e barato para produzir altos níveis deproteínarecombinante. O foco deste trabalho foi construir e avaliar dois plasmídeos (pPICZAαL1B2 e pPICZAL1B2), como vetores para expressão do geneL1BPV-2 em células de P. pastoris. Um deles (pPICZAαL1B2) insere na proteína recombinante um sinal de secreção (α-mating). Assim, esperou-se comparar a eficiência da expressão heteróloga através das viasintra e extracelulares. O gene L1 foi amplificado por PCR do genoma completo BPV-2, foi clonado em vetor pGEM-T(Promega ®) e, posteriormente, foi subclonado nos vetores de expressão pPICZA e pPICZAα (Invitrogen ®). PCR e análise de restrição indicarama inserção correta do gene L1 em ambos os vetores, bem como o seqüenciamento. Por eletroporação, P. pastoris (cepa de levedura X-33) foi transformada com a construção pPICZAL1B2 ou pPICZAαL1B2, cuja integração no genoma de levedura pode ser identificada por PCR da colônia. As leveduras transformadas foram selecionadas para experimentos de cultura com indução com metanol. A expressão de L1 foi indicada por RT-PCR e análise de proteínas. A proteína recombinante L1foi detectada em células de levedura, que sofreram tratamento com solução de lise (via intracelular) e em meio de cultura submetido a precipitação com acetona (via extracelular). Este estudo fornece um caminho para uma estratégia de vacina com VLP contra papilomaviroses bovina e apresenta um modelo experimental para estudos de papilomatosessimilares, além de mostrar um modelo experimental interessante para futuras aplicações em seres humanos.Papillomaviruses are a group ofsmall double-stranded DNA viruses characterized by inducingthe formation of lesions that are usually benign and may regress naturally, but also havethe potential to become malignant tumors. The human papillomavirus (HPV) is strongly related to sexually transmitted diseases (STDs) and is a major cause of cervical cancer. The bovine papillomavirus (BPV), in turn, represents a serious economic problem in terms of livestock. In cattle,cutaneous and mucosal papillomatosis at genital and oropharyngeal regionsare the most common. There are six different types of BPV (BPV 1-6) well characterized and, recently, four new types (BPVs 7-10) havebeen sequenced.In theNortheast, especially inthe state of Pernambuco (Zona da Mata), the incidence of bovine papillomatosis isveryhigh,causing great economic losses for breeders. There isno treatment with proven efficacy. Protection against infection is conferred by neutralizing antibodies directed against structural L1proteinconformational epitopes. These antibodies can be efficiently induced by immunization with virus-like particles (VLP) that are formed spontaneously after L1 expression in heterologous systems. In recent years, the methylotrophic yeast Pichia pastorishas emerged as an efficient and inexpensive heterologous system to produce high protein levels. The focus of this paper is to construct andevaluate two plasmids (pPICZAαL1B2 and pPICZAL1B2), as vectors to gene expression of L1BPV-2 in cells of P. pastoris. One of them (pPICZAαL1B2) inserts a secretion signal (α-matting)on recombinant protein. Thus, it had been expected to compare the heterologous expression via intracellular and extracellular pathway efficiency. L1 gene has been amplified by PCR from the complete BPV-2 genome, has been cloned into pGEM-T vector (Promega®) and, subsequently, has been sub cloned into pPICZA and pPICZAαexpression vectors (Invitrogen®). PCR and restriction analysis haveindicated the correct insertion of the L1 gene in both vectors, as well as sequencing. By electroporation, P. pastoris(strain X-33 yeast) has been transformed with pPICZAL1B2 orpPICZAαL1B2 constructions, whose integration into yeast genome could be identified by colony PCR. Transformed yeast has been selected to culture experiments withmethanol induction. L1 expression has been indicated by RT-PCR and protein analysis. L1 recombinant protein has been detected in yeast cells that has undergonelysis solution treatment (intracellular pathway) and from the culture medium acetone precipitation submitted (extracellularpathway). This study provides a way for a VLP-vaccine strategyagainst bovine papillomaviroses and exhibits an experimental model for similar papillomatosis studies, whileshowingan interesting experimental model for future applications in humans