Avaliação da importância para a viabilidade celular de três homólogos do fator de iniciação da tradução EIF4E de Leishmania sp

A família de protozoários tripanosomatídeos apresenta características moleculares diferenciadas dos demais eucariotos, onde a regulação da expressão gênica é feita principalmente em nível pós-transcricional. Como em outros eucariotos, acredita-se que a iniciação da tradução seja uma etapa crítica de controle pós-transcricional, onde atuam diferentes fatores de iniciação da tradução (eIFs). Nesta etapa os pontos centrais são o reconhecimento do mRNA maduro e o recrutamento do ribossomo para dar início ao processo, atividades realizadas pelo complexo eIF4F, formado por três subunidades: eIF4E, eIF4A e eIF4G. Nos tripanosomatídeos foram descritos seis homólogos de eIF4E, a proteína de ligação ao cap. Dois destes, EIF4E3 e EIF4E4, participam da formação de complexos envolvidos no processo de tradução e outros dois, EIF4E5 e EIF4E6, participam de novos complexos de função desconhecida. Destes quatro homólogos, o EIF4E4 já foi caracterizado, de forma que o presente trabalho visa contribuir para o entendimento da importância dos demais (EIF4E3, EIF4E5 e EIF4E6) na viabilidade e taxa de crescimento celular de Leishmania sp. Construções gênicas foram geradas de forma a permitir a deleção das duas cópias gênicas de cada proteína por meio da transfecção de Leishmania e seleção com antibióticos. As três proteínas, e mutantes do EIF4E3, foram ainda expressas em parasitas transgênicos para a realização de experimentos de complementação. Os resultados mostram que os baixos níveis de expressão de EF4E5 e EIF4E6 indicam que as três proteínas parecem ser importantes para a viabilidade celular com funções não sobrepostas. Sítios específicos no EIF4E3 foram também identificados de forma isolada como essenciais para a função da proteína e críticos para a sobrevivência do organismo. Os resultados obtidos neste trabalho mostram a importância do estudo do papel destes homólogos de eIF4E na síntese protéica, assim com seu papel na biologia celular de tripanossomatídeos.The Trypanosomatid of protozoans display distinct molecular features not seen in other eukaryotes, where the regulation of gene expression is mainly performed at the post-transcriptional level. As in other eukaryotes, it is believed that the initiation of translation is a critical stage of post-transcriptional control, where different initiation factors (eIFs) are active. At this stage, critical steps are the recognition of the mature mRNA and the ribosome recruitment to start the process, activities of the eIF4F complex, consisting of three subunits: eIF4E, eIF4A and eIF4G. In trypanosomatids, six homologues of eIF4E, the cap binding protein, have been described. Two of these, EIF4E3 and EIF4E4, participate in the formation of complexes involved in the translation process and two others, EIF4E5 and EIF4E6, participate in new complexes of unknown function. Among these four homologues, EIF4E4 has been better characterized, so that the present work aims to contribute to the understanding of the remaining homologues (EIF4E3, EIF4E5 and EIF4E6) and study their importance for cell viability and growth rate of Leishmania species. Gene constructs were generated to allow deletion of the two gene copies of each protein by transfection of Leishmania cells and selection with antibiotics. The three proteins and EIF4E3 mutants were also expressed in transgenic parasites in order to carry out complementation experiments. The results show low levels of expression of EF4E5 and EIF4E6 and indicate that the three proteins appear to be important for cell viability with non-overlapping functions. EIF4E3 specific residues were also identified which are essential for the protein to the function and critical for the survival of the organism. The results of this study highlight the importance of the study on the role of eIF4E homologues in protein synthesis, as well as their role for the trypanosomatids cell biology