Avaliação de ferramentas moleculares para detecção de fungos patogênicos relevantes para a saúde humana

FACEPEInfecções fúngicas tem aumentado sua incidência, principalmente em imunocomprometidos. No Brasil, os fungos são responsáveis por cerca de 10% das infecções hospitalares, sendo as espécies de Candida responsáveis por cerca de 50% dos casos, seguidas pelo Aspergillus e Cryptococcus neoformans. O diagnóstico fúngico é dado pelo exame direto, que possui reduzida sensibilidade, e cultura que é tecnicamente laboriosa e demorada. A detecção do genoma de fungos apresenta diversas vantagens como a instalação precoce da terapia antifúngica diminuindo a mortalidade relacionada à infecção fúngica, e o tempo de internação dos pacientes em unidades de saúde. Este estudo tem como objetivo o desenvolvimento e avaliação de teste molecular para a detecção de infecção fúngica em pacientes imunocomprometidos através de PCR do tipo multiplex utilizando a sequência ITS como alvo, e sequências de rDNA específicas para detecção de 6 espécie de fungos de importância para a saúde humana: A. fumigatus, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. neoformans. Dos 84 pacientes analisados, 46 foram adultos em tratamento oncológico e 38 neonatos. Das 144 amostras de sangue submetidas a PCR convencional com os iniciadores para a detecção da região ITS, 84 foram positivas e 60 negativas. As amostras positivas foram submetidas a PCR multiplex para a determinação da espécie do fungo. 46 foram positivas para uma ou mais espécie fúngica, sendo as espécies mais encontradas a C. parapsilosis (23,8%), C. glabrata (19,0%), C. neoformans (14,2%), C. tropicalis e C. albicans (ambas 4,7% dos casos). A baixa frequência de C. albicans possivelmente está relacionada ao uso profilático do antifúngico fluconazol. A PCR convencional apresentou sensibilidade de 67,3% (53,2-79,0), especificidade de 47,2% (36,6-58,0), valor preditivo positivo de 44,0% (33,4-55,3) e valor preditivo negativo de 70,0% (56,6-80,8) em relação ao diagnóstico da doença, baseado na clínica, comprovação microbiológica e teste terapêutico. As curvas melting da PCR em tempo real utilizando o sistema de detecção SYBR Green obtidas pela amplificação da sequência subclonada de rDNA de cada espécie em plasmídeo apresentaram formato alargado, possivelmente devido a homologia entre o iniciador e diferentes regiões das sequências de rDNA das espécies de fungos estudadas, principalmente nas espécies de Candida, permitindo a amplificação inespecífica em diferentes temperaturas de anelamento avaliadas. As curvas de amplificação das sequências subclonadas de rDNA de cada espécie utilizando o sistema TaqMan apresentaram reprodutibilidade, e especificidade nos experimentos utilizando o par de iniciador e sonda especifico para uma dada espécie com sequências de rDNA clonadas das demais espécies de fungos analisadas, executando o teste para C. neoformans, mostrando o potencial do teste para utilização em amostras clínicas.Fungal infections have increased its incidence, especially in immunocompromised patients. In Brazil, the fungi are responsible for about 10 % of nosocomial infections, with Candida species account for about 50% of cases, followed by Aspergillus and Cryptococcus neoformans. Fungal diagnosis is made by direct examination, which has reduced sensitivity, and culture that is technically laborious and time consuming. The detection of the fungal genome has several advantages as the early onset of antifungal therapy decreased mortality related to fungal infection, and length of stay of patients in healthcare facilities. This study aims at the development and evaluation of molecular test for the detection of fungal infection in immunocompromised patients by multiplex PCR using ITS sequence targeted and specific rDNA sequences for detection of 6 species of fungi of importance to the human health: A. fumigatus, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis and C. neoformans. Of the 84 patients studied, 46 were adults undergoing cancer treatment and 38 neonates. 144 of blood samples with conventional PCR primers for detection of the ITS region, 84 were positive and 60 negative. The positive samples were subjected to multiplex PCR to determine the species of fungus. 46 were positive for one or more fungal species and the species most commonly found in C. parapsilosis (23.8%), C. glabrata (19.0%), C. neoformans (14.2%), C. tropicalis and C. albicans (both 4.7% of cases). The low frequency of C. albicans is probably related to the prophylactic use of antifungal fluconazole. Conventional PCR had a sensitivity of 67.3% (53.2 to 79.0), specificity of 47.2% (36.6 to 58.0), positive predictive value of 44.0% (from 33.4 to 55,3) and negative predictive value of 70.0% (56.6 to 80.8) compared to diagnosis based on clinical, microbiological and therapeutic proof test. The melting curves of real-time PCR using SYBR Green obtained by amplification of rDNA subcloned sequence of each species present in plasmid extended, possibly due to the homology between the initiator sequences and regions of rDNA of fungal species format studied, especially in Candida species, allowing nonspecific amplification at different annealing temperatures evaluated. The amplification curves of the subcloned rDNA sequences of each type using the TaqMan system showed reproducibility and specificity of the experiments using the pair of primer and probe specific for a species with cloned rDNA sequences of other species of fungi analyzed by running test for C. neoformans, showing the potential for use in clinical test samples