Produção, caracterização e purificação da colagenase do Penicillium aurantiogriseum URM-4622, visando sua aplicação na produção de peptídios do colágeno

Colagenases são enzimas proteolíticas capazes de degradar a região helicoidal do colágeno em pequenos fragmentos. Em contraste com as colagenases de mamíferos, que clivam a hélice do colágeno em um único ponto, as colagenases microbianas atacam múltiplos sítios ao longo da hélice e por este motivo vem sendo largamente aplicadas na obtenção de peptídeos bioativos do colágeno. Devido ao uso potencial das colagenases microbianas na produção de peptídeos bioativos, existe um interesse em encontrar novas linhagens de fungos capazes de produzir estas enzimas com novas características e em um meio de produção com baixo custo industrial. O presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção da colagenase do Penicillium aurantiogriseum utilizando um meio de produção econômico a base de farinha de soja, caracterizar a enzima obtida a partir das condições de cultivo mais favoráveis, aplicar o sistema de duas fases aquosas (SDFA) polietileno glicol (PEG)/fosfato para pré-purificar a colagenase do meio de fermentação e utilizar a cologanase na forma pré-purificada para a produção de peptídeos bioativos do colágeno bovino tipo I. Três planejamentos experimentais (24 e 23 fatorial completo e um 22 central composto) foram empregados para otimizar a produção da colagenase. Os resultados do planejamento completo 24 indicaram que as variáveis mais significativas para a produção da colagenase foram a concentração da farinha de soja e o pH inicial do meio de cultura que exerceram efeitos positivos, e a temperatura que exerceu efeito negativo. Os resultados do planejamento completo 23 indicaram que o pH inicial do meio de cultura e a temperatura exerceram efeitos negativos significativos, enquanto que a concentração da farinha de soja apresentou efeito positivo na produção da colagenase. A produção enzimática máxima (283,36  1,33 U) foi obtida a 1,645% (m/v) de farinha de soja, pH 7,21 e 24 ºC, conforme predita pela superfície de resposta. A enzima apresentou uma atividade máxima a pH 9,0 e 37 ºC, foi estável em uma ampla faixa de pH (6,0 a 10,0) e temperatura (25 a 45 ºC) e foi fortemente inibida por 10 mM de fenil metil sulfonil fluoreto. A energia de ativação e a entalpia de ativação da enzima foram 107,4 kJ/mol e 104,7 kJ/mol, respectivamente. A análise dos resultados do planejamento fatorial 24 utilizado para estudar a influência da massa molar do PEG (MMPEG), da concentração do PEG (CPEG), da concentração do fosfato (CFOSF) e do pH na extração da colagenase no SDFA indicou que o fator de purificação (FP), o coeficiente de partição (K) e o rendimento em atividade (Y) da colagenase na fase superior aumentaram com o aumento da CPEG e da CFOSF e com a diminuição da MMPEG e do pH. O FP máximo (5,23) foi obtido com MMPEG de 1500 g/mol, CPEG de 17,5% (m/m), CFOSF de 15% (m/m) e pH 6,0, enquanto que o Y máximo (167,01%) foi obtido com MMPEG de 1500 g/mol, CPEG de 17,5% (m/m), CFOSF de 10% (m/m) e pH 8,0. A eficiência do SDFA foi confirmada pelo estudo eletroforético, que revelou a eliminação de proteínas contaminantes. Os resultados do planejamento fatorial completo 23 utilizado para identificar as condições mais favoráveis de hidrólise do colágeno bovino tipo I, a partir da colagenase prépurificada do P. aurantiogriseum, indicaram que o pH e a concentração do colágeno exerceram efeitos positivos sobre o grau de hidrólise, enquanto que o efeito da temperatura foi negativo. O grau de hidrólise máximo (4,65 μmol/mL) foi obtido utilizando uma concentração de colágeno de 7,5 mg/mL, pH 8,0 e 25 ºC. O perfil de peptídeos obtido por espectrometria de massa mostrou a presença de peptídeos com massas molares inferiores a 11 kDa e inúmeros peptídeos com massas molares menores de 2 kDa. Estes peptídeos apresentaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli (CIM = 0,625 mg/mL), Bacillus subtilis (CIM = 5 mg/mL) e Staphylococcus aureus (CIM = 0,55 mg/mL) e atividade antioxidante de 84,7 ± 0,24% (50 mg/mL). Os resultados do presente trabalho demonstram que P. aurantiogriseum é produtor de colagenase, a qual é uma alternativa tecnologicamente viável para a produção de peptídeos bioativos do colágen