α-Amilases dos peixes Colossoma macropomum, (Cuvier, 1818) e Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) : propriedades e aplicações biotecnológicas

CAPESA recuperação e reutilização dos subprodutos do processamento pesqueiro têm sido discutidas como alternativas sustentáveis para manejo dos resíduos gerados pela aquicultura. Esses subprodutos são considerados potenciais fontes de biomoléculas com demanda biotecnológica e baixo custo. Diante dessa perspectiva, a presente tese descreve a obtenção e caracterização dos parâmetros físico-químicos, cinéticos e termodinâmicos das α-amilases dos peixes tilápia do Nilo e tambaqui, e propõe aplicações biotecnológicas para essas enzimas. No artigo 1 foram abordadas a purificação da α-amilase intestinal da tilápia (AMY-T), e sua caracterização cinética/bioquímica. A α-amilase mostrou atividade ótima no pH 5.0, e termoestabilidade até 50°C. Observou-se a importância do pH para o mecanismo catalítico, visto que os parâmetros cinéticos mudaram com a variação do pH. AMY-T foi fortemente ativada por Cl- que, além de ativador alostérico, conferiu termoestabilidade à enzima. Brometo e iodeto também ativaram AMY-T, embora em menor proporção comparado ao cloreto, mostrando que o sítio de ligação do cloreto apresenta plasticidade para outros íons. A α-amilase foi resistente à EDTA e EGTA, sugerindo que sua atividade independe de cálcio. O artigo 2 avaliou a aplicação da α-amilase da tilápia no processamento enzimático de grãos nativos de amido de batata. A α-amilase adsorveu e hidrolisou amido, sob baixas temperatura e concentrações de enzima, e suspensões concentradas de amido (10% e 15%), alcançando grau de hidrólise de até 45%. Estudos microscópicos (MEV) confirmam a ação enzimática através das mudanças morfológicas causadas na estrutura dos grãos de amido. A α-amilase digeriu uma variedade de carboidratos, mostrando preferência por ligações glicosídicas α-1→4. Foi estável à ampla faixa de pH e vários solventes orgânicos durante 24h de incubação. Os principais produtos gerados foram glicose, maltose e maltodextrinas, indicando uma amilase com propriedades sacarificadoras, e sugerindo a aplicação dessa enzima no processamento industrial do amido. No artigo 3, α-amilases oriundas do intestino (AMY-1) e cecos pilóricos (AMY-2) do tambaqui foram parcialmente purificadas, caracterizadas e avaliadas como aditivo de limpeza em detergentes comerciais. Foi proposta uma metodologia para obtenção de enzimas digestivas, viabilizando o isolamento de α-amilases e tripsinas em um único procedimento. As α-amilases mostraram atividade ótima no pH 7.0 (AMY-1) e 8.5 (AMY-2), temperatura ótima de 60°C e termoestabilidade até 40°C durante 60 min. Foram inibidas por Cu⁺ e Hg⁺ e não foram ativadas na presença de Ca²⁺, apresentando resistência a quelantes. Foi observada boa digestibilidade de diferentes substratos, exceto maltose, confirmando a natureza amilácea das enzimas. A análise dos parâmetros cinéticos mostrou afinidade similar por amido, entretanto, AMY-2 apresentou melhor desempenho catalítico. Ambas foram resistentes aos agentes oxidantes e surfactantes, e compatíveis com todas as marcas de sabões comerciais testados, mesmo quando comparadas à α-amilase comercial de Bacillus subtillis, o que sugere a potencial aplicação dessas enzimas na indústria de detergentes. Os resultados obtidos através dessa pesquisa apontam para a utilização dos resíduos do processamento pesqueiro como fonte de α-amilases com perfil compatível com vários seguimentos industriais, e endossam a necessidade e importância de preencher uma lacuna existente no estudo das enzimas de peixes, sobretudo α-amilases.The recovery and reutilization of fish processing waste have been considered as a sustainable alternative for the management of waste generated through aquaculture activities. These by-products are considered as potential sources of biomolecules with biotechnological demand and low cost. Thus, this work describes the obtaining and characterization of physico-chemical, kinetic and thermodynamic parameters of α-amylases from the tropical fishes Nile tilapia and tambaqui, and proposes biotechnological applications for these enzymes. On the chapter 1 the purification and kinetic/biochemical characterization of α-amylase from tilapia viscera (AMY-1) were evaluated. The α-amylase showed optimum activity at pH 5.0 and thermal stability until 50°C. It was observed the role of pH on catalytic mechanism, once the kinetic parameters were shifted according the pH. AMY-T was highly actived by chloride ion, which beside to acts as allosteric activator, enhanced the thermal stability. Bromide and iodide also acts as effectors of α-amylase, though in less extend in comparison to chloride, showing that the chloride site binding has plasticity toward other ions. In addition, it was observed resistance to chelating agents EDTA and EGTA, suggesting that AMY-T activity is calcium independent. The chapter 2 evaluated the application of tilapia α-amylase in enzymatic processing of raw potato starch. This enzyme was able to adsorb and hydrolyze raw starch, at low concentration of enzyme and temperature, and also high concentrated starch suspensions (10 and 15%), achieving a hydrolysis degree of 45%. The scanning electron microscopy confirms the enzymatic action by the morphological changes on the raw potato granules. The α-amylase was able to digest a variety of carbohydrates, showing preference to cleave glycosidic bonds α-1→4. It was highly stable at wide pH range and also to several organic solvents after 24h of incubation. The mainly products of hydrolysis were glucose, maltose and maltodextrins, suggesting a saccharifier enzyme and indicating the application of this enzyme on starch industry. On the chapter 3, α-amylases from intestine (AMY-1) and pyloric caeca (AMY-2) of tambaqui were partially purified and proposed as cleaning additive in commercial detergents. A new methodology to purify digestive enzymes was proposed, and it was possible to obtain α-amylases and trypsin in a single procedure. The α-amylases showed optimum activity at pH 7.0 (AMY-1) and 8.5 (AMY-2), optimum temperature of 60°C and thermal stability up 40°C for 60 min. Both were inhibited by Cu⁺ and Hg⁺, they were not active by Ca²⁺ and showed resistance to chelating agents. The enzymes showed digestibility toward different substrates, except to maltose, confirming their amylaceus profile. They had similar affinity to starch, but AMY-2 showed better catalytic performance. Both were highly resistant to oxidizing agents and surfactants, and showed compatibility to all brands of commercial laundry tested, even in comparison to commercial α-amylase of Bacillus subtilis, suggesting the potential application of these enzymes on laundry industry. The results obtained points to use of fish processing waste as source of α-amylases compatible with various industrial sectors, and emphasizes the need and importance of filling a gap in study of fish enzymes, mainly α-amylases