Isolamento, avaliação e identificação de micro-organismos endofíticos de folhas de Bauhinia monandra e suas interações com a lectina de folhas (BmoLL)

FACEPENão existem estudos no que se refere à identificação de micro-organimos endofíticos de Bauhinia monandra, embora sejam relatados diversos estudos farmacológicos realizados com essa espécie. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi à prospecção de micro-organismos endofíticos de folhas de B. monandra, no intuito de identificar estes endofíticos, bem como explorar o potencial biotecnológico das actinobactérias endofíticas para produção enzimática e antimicrobiana. Folhas de B. monandra coletadas no Campus da Cidade Universitária (Recife, PE) foram desinfectadas, maceradas e semeadas em meios de cultura específicos. Após a purificação, as colônias bacterianas e fúngicas foram submetidas à identificação morfológica macroscópica e microscópica. As actinobactérias endofíticas foram avaliadas quanto à produção de enzimas; bem como foi realizada a avaliação antimicrobiana para seleção da estirpe com elevado potencial antimicrobiano e posterior produção de metabólitos ativos em cultivo submerso, seguido de processos de extração e separação cromatográfica dos compostos antimicrobianos obtidos do melhor meio de cultura. No presente estudo, as estirpes de fungos filamentosos endofíticos (59,7%) pertenciam aos gêneros Penicillium, Curvullaria e Aspergillus. As bactérias não-filamentosas endofíticas (26,9%) foram agrupadas nos gêneros Bacillus, Burkholderia, Enterobacter. E cepas de actinobactérias endofíticas (13,4%) foram classificadas como Streptomyces e Nocardiopsis. A metodologia utilizada para verificar quantitativamente a capacidade de produção enzimática foi eficiente, demonstrando que todas as actinobactérias endofíticas (n=9) das folhas de B. monandra foram capazes de hidrolisar amido, pectina, Tween 20 e 80; e celulose, confirmando a presença de amilase, pectinase, lípase, esterase e celulase, respectivamente. Na avaliação da produção de caseinase todas as actinobactérias endofíticas foram positivas, no entanto, para a degradação da gelatina apenas Nocardiopsis spp. 2F foi negativo, bem como no ensaio de tirosina todas as estirpes foram positivas exceto Streptomyces spp. 1F. A avaliação da atividade antimicrobiana primária das actinobactérias endofíticas de folhas de B. monadra, realizada pelo teste de bloco de gelose mostrou que as cepas endofíticas Nocardiopsis spp. 2F, Streptomyces spp. 3F, Streptomyces spp. 5F, Streptomyces spp. 6F e Streptomyces spp. 8F, possuíam atividade antimicrobiana apenas diante de bactérias Gram-positivas, principalmente cepas de Staphylococcus aureus (n=16) isolados clínicos multiressistentes e oxacilina resitente (ORSA). A estirpe endofítica Streptomyces spp. 5F destacou-se como melhor produtor de substâncias antimicrobianas em 11 dos 12 meios de cultura submersa perante cinco cepas de S. aureus isolados clinicos, selecionando o meio ISP-3 com melhor desempenho produtivo. O processo extrativo dos produtos ativos com solventes foi bem sucedido com a massa micelial, destacando-se o metanol. Segundo separação cromatográfica de alta eficiência dos extratos brutos: aquoso do líquido metabólico (EAL) e metánolico da massa (EMM), o fracionamento demonstrou que os dois extratos apresentavam compostos com natureza polar. Estes resultados demonstram que a prospecção de micro-organismos endofíticos constitui uma fonte valiosa na obtenção de novas espécies e novos metabólitos bioativos, bem como a descoberta de moléculas com atividade enzimática e antimicrobiana promissora diante de bactérias multirresitentes do gênero Staphylococcus.There are no studies regarding the identification of endophytic microorganisms of Bauhinia monandra, although several pharmacological studies with this species are reported. In this way, the objective of this work was to prospect endophytic microorganisms from B. monandra leaves, in order to identify these endophytes, as well as to explore the biotechnological potential of endophytic actinobacteria for enzymatic and antimicrobial production. B. monandra leaves collected at Campus Cidade Universitária (Recife, PE) were disinfected, macerated and seeded in specific culture media. After purification, bacterial and fungal colonies were submitted to macroscopic and microscopic morphological identification. Endophytic actinobacteria were evaluated for enzyme production; As well as the antimicrobial evaluation for selection of the strain with high antimicrobial potential and subsequent production of the active metabolites in submerged culture, followed by extraction and chromatographic separation of the antimicrobial compounds obtained from the best culture medium. In the present study, strains of endophytic filamentous fungi (59.7%) belonged to the genera Penicillium,Curvullaria and Aspergillus. Endophytic non-filamentous bacteria (26.9%) were grouped in the genera Bacillus, Burkholderia, Enterobacter. And strains of endophytic actinobacteria (13.4%) were classified as Streptomycesand Nocardiopsis. The methodology used to verify quantitatively the enzymatic production capacity was efficient, demonstrating that all the endophytic actinobacteria (n = 9) of B. monandra leaves were able to hydrolyze starch, pectin, Tween 20 and 80, and cellulose, confirming the presence of amylase, pectinase, lípase, esterase and cellulase, respectively. In the evaluation of the caseinase production, all the endophytic actinobacteria were positive, however, for the degradation of the gelatin only Nocardiopsis spp. 2F was negative, as well as in the tyrosine assay all strains were positive except Streptomyces spp. 1F. The evaluation of the primary antimicrobial activity of the endophytic actinobacteria of B. monadra leaves, performed by the gel block assay showed that the endophytic strains Nocardiopsis spp. 2F, Streptomyces spp. 3F, Streptomyces spp. 5F, Streptomyces spp. 6F and Streptomyces spp. 8F, had antimicrobial activity only against Gram-positive bacteria, mainly strains of Staphylococcus aureus (n = 16), multiresistant clinical isolates and resistant oxacillin (ORSA). The endophytic strain Streptomyces spp. 5F was the best producer of antimicrobial substances in 11 of the 12 submerged culture media against five strains of S. aureus isolates clinically, selecting ISP-3 medium with better productive performance. The extractive process of the active products with solvents was successful with the mycelial mass, standing out the methanol. According to the high efficiency chromatographic separation of the crude extracts: aqueous of the metabolic liquid (AEL) and mass methanol (MME), the fractionation showed that the two extracts presented compounds with polar nature. These results demonstrate that the prospection of endophytic microorganisms is a valuable source in the acquisition of new species and new bioactive metabolites, as well as the discovery of molecules with promising enzymatic and antimicrobial activity against multiresistant bacteria of the genus Staphylococcus