The influence of colostrum leukocytes in the development of intestinal microbiota, innate immune response, and incidence of diarrhea in newborn calves

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a influência dos leucócitos do colostro bovino na imunidade inata, desenvolvimento da microbiota intestinal e ocorrência de diarreias em bezerras Holandesas recém-nascidas. Para isso, 20 bezerras Holandesas foram acompanhadas nos seguintes momentos: antes da mamada do colostro (D0); 1-2 (D2); 7 (D7); 14 (D14); 21 (D21) e 28 (D28) dias após nascimento e foram distribuídas em dois grupos experimentais: grupo COL+ recebeu colostro fresco (4L) proveniente de suas respectivas mães; e grupo COL- recebeu colostro congelado e acelular (4L) de vacas doadoras. Capítulo 1 O objetivo deste capítulo foi avaliar a presença e influência dos leucócitos do colostro na colonização do trato gastrintestinal. Para isso, amostras de colostro foram semeadas em TSA e MacConkey para CBT e CCT; e amostras de fezes em agar sangue, MacConkey e Salmonella-Shiguella. Bezerras apresentaram maior frequência de diarreia no D14 (COL+=78%; COL-=60%). O grupo COL- apresentou maior CBT e CCT/mL (3,93x106 ufc/mL e 3,01x105 ufc/mL) em relação ao COL+ (0,94x106 ufc/mL e 0,78x105ufc/mL). Sobre as espécies bacterianas isoladas, as que foram mais frequentes no COL+ foram Proteus mirabilis (29,91%), Escherichia coli (28,04%), Citrobacter freundii (5,61%) e Staphylococcus spp (5,61%), no COL- foram Escherichia coli (28,70%), Proteus mirabilis (27,78%), Klebsiella pneumoniae (11,32%) e Morganella morganii (5,66%). O momento com maior isolamento em ambos os grupos foi o D2 (COL+ = 26 cepas; COL- = 27 cepas), período em que iniciou a diarreia nas bezerras. Não foi possível detectar diferenças entre as frequências de microrganismos entre os grupos COL+ e COL-. A administração de colostro COL+ e COL- não influenciou na proporção de bactérias aeróbias presentes nas fezes e na ocorrência de diarreia das bezerras durante o período neonatal. Capítulo 2 O objetivo deste capítulo foi avaliar a influência dos leucócitos do colostro na resposta imune inata em bezerras Holandesas. Os animais foram submetidos ao exame clínico, seguido da colheita das amostras sanguíneas para realização das provas laboratoriais. As concentrações de cortisol sérico e haptoglobina não apresentaram diferenças estatísticas, enquanto a concentração de ferro foi diferente entre os grupos no D7. No leucograma não foi detectada diferença para os leucócitos totais e neutrófilos absolutos, mas houve tendência entre os grupos no D7 para os valores de neutrófilos relativos. O marcador CH138+CD62L+ não apresentou diferença entre os grupos, apesar da maior expressão ter sido detectada no COL-. A expressão de CH138+CD62L- foi maior no COL+ no D14. A fagocitose e produção de H2O2 pelos neutrófilos sanguíneos apresentou perfil semelhante em relação ao S. aureus e E. coli entre os grupos, apesar do COL- apresentar maior intensidade de fagocitose do D7 ao D14. Houve tendência para o aumento da proporção de granulócitos liberando H2O2 basal no D14 para o COL-, entretanto o COL + apresentou tendência para maior intensidade da fagocitose no D21. A proporção de granulócitos (%), estimulados com S. aureus, liberando H2O2 foi maior no COL+ em D7, enquanto o estímulo com a E. coli não resultou em diferenças entre os grupos. A intensidade de fluorescência foi maior e gradual no COL+ quando as células foram estimuladas, porém não foram encontradas diferenças estatísticas. As células do colostro influenciaram no perfil sanitário apresentado pelas bezerras, observando-se maior intensidade de diarreias, menores teores de ferro sérico e anemias no grupo que recebeu colostro congelado. A migração dos granulócitos sanguíneos foi mais rápida e intensa no COL+ em relação ao COL-, após exposição natural aos patógenos causadores de diarreia. O índice de fagocitose (%) dos granulócitos apresentou semelhança entre os grupos, entretanto a intensidade da fluorescência foi mais intensa no COL-. Em contrapartida, o COL+ demonstrou maior habilidade em produzir H2O2The aim of this study was to evaluate the influence of bovine colostrum leukocytes in innate immunity, in the development of the intestinal microbiota and the occurrence of diarrhea in newborn Holstein calves. For this, 20 Holstein calves were followed in the following moments: before colostrum intake (D0); 1-2 (D2); 7 (D7); 14 (D14); 21 (D21) and 28 (D28) days after birth. They were divided into two experimental groups: COL+ group, which received fresh colostrum (4L) from their mothers; and COL-group which received frozen and acellular colostrum (4L) of donor cows. Chapter 1 -The aim of this chapter was to evaluate the presence and influence of colostrum leukocytes in the colonization of the gastrointestinal tract. For this, colostrum samples were seeded in TSA and MacConkey for TPC and TCC; and stool samples on blood agar, MacConkey and Salmonella-Shiguella. Calves presented higher frequency of diarrhea in D14 (COL+ = 78%; COL- = 60%). The COL- group showed higher TPC and TCC/mL (3,93x106 cfu/mL and 3,01x105 cfu/mL) compared to COL+ (0,94x106 cfu/mL and 0,78x105 cfu/mL). Regarding the isolated bacterial species, those that were more frequent in the COL+ were Proteus mirabilis (29.91%), Escherichia coli (28.04%), Citrobacter freundii (5.61%) and Staphylococcus spp (5.61%); in the COL-were Escherichia coli (28.70%), Proteus mirabilis (27.78%), Klebsiella pneumoniae (11.32%) and Morganella morganii (5.66%). The moment with more insolation in both groups was the D2 (COL+ = 26 strains; COL- = 27 strains), period in which started the diarrhea in calves. It was not possible to detect differences between the frequencies of microorganisms between the COL+ and COL- groups. The COL+ and COL- colostrum management did not influence the proportion of aerobic bacteria present in feces and the occurrence of diarrhea in calves during the neonatal period. Chapter 2 The aim of this chapter was to evaluate the influence of colostrum leukocytes in the innate immune response in Holstein calves. The animals were submitted to clinical examination, followed by blood samples collection to perform laboratory tests. The serum cortisol and haptoglobin concentrations did not show statistical differences while the iron concentration was different between groups at D7. The leukogram did not show difference to total leukocytes and absolute neutrophils, but there was a trend between groups at D7 for relative values of neutrophils. The CH138+CD62L+ marker showed no difference between groups, despite an increased expression was detected in COL-. The expression of CH138+CD62L- was greater in COL+ at D14. The phagocytosis and production of H2O2 by blood neutrophils showed similar profile in relation to S. aureus and E. coli between groups, although COL- presented greater phagocytosis intensity from D7 to D14. There was a trend for the increase of granulocyte proportion, releasing basal H2O2 at D14 for COL-, however COL+ presented trend to a higher intensity of phagocytosis at D21. The proportion of granulocytes (%) stimulated with S. aureus releasing H2O2 was greater in COL+ at D7, while stimulation with E. coli resulted in no differences between the groups. The fluorescence intensity was higher and gradual in COL+ when cells were stimulated; however, it was not detected statistical differences. The colostrum cells influenced in the health profile presented by the calves, with a higher intensity of diarrhea, lower levels of serum iron and anemia in the group that received frozen colostrum. The migration of blood granulocytes was faster and more intense in COL+ in relation to COL- after natural exposure to pathogens that cause diarrhea. The phagocytosis rate (%) of granulocytes showed similarity between groups, although the fluorescence intensity of COL- was more intense. In contrast, the COL+ demonstrated greater ability in producing H2O