Alpha and beta-amylase in the starch metabolism during banana ripening: cloning, expression and molecular characterization.

A conversão do amido, armazenado nas frutas durante seu desenvolvimento, em açúcares, é desempenhada por várias enzimas, constituindo-se em um dos principais processos do amadurecimento. A função das enzimas hidrolíticas, alfa-amilase e beta-amilase, no metabolismo amido-sacarose durante o amadurecimento de bananas, foi avaliada através da determinação dos perfis de transcrição e tradução dos seus genes. Utilizando-se da expressão heteróloga de clones de cDNA das amilases, foi possível obter as proteínas recombinantes, inclusive na sua forma enzimaticamente ativa, bem como induzir a produção de anticorpos policlonais em coelhos, com os quais pode-se acompanhar a variação nos níveis de expressão de cada uma das duas enzimas. O tratamento de bananas com o hormônio etileno induziu a antecipação dos processos de degradação do amido e síntese de açúcares em relação ao grupo de frutas controle. Enquanto no grupo controle, as variações nos níveis de proteína e transcrição relativos à alfa-amilase sugerem que há redução na expressão do gene, no grupo tratado com etileno não foi possível detectar a expressão da proteína, apesar dos incrementos na transcrição e atividade. Tal fato pode ser associado à degradação do grânulo de amido e conseqüente solubilização de proteínas ligadas à sua superfície e ao provável aumento no turnover de proteínas promovidos pelo etileno. Em resposta ao tratamento com etileno, houve antecipação dos picos de atividade relacionados especificamente com a beta-amilase, o mesmo ocorreu na detecção do transcrito e sua proteína. Tais resultados sugerem que em bananas, os padrões de expressão e atividade da beta-amilase estão diretamente relacionados à degradação do amido, respondendo também às variações hormonais na fruta, não sendo possível afirmar o mesmo para alfa-amilase.The starch breakdown in plants is accomplished by several enzymes and pathways and it is the main feature of the ripening in climacteric fruits, such as banana. The function of the hydrolytic enzymes, alpha-amylase and beta-amylase, in the starch-to-sugar metabolism during banana ripening, was evaluated through the determination of the profiles of transcription and translation of its genes. Using the heterologous expression of amylases cDNA clones, was possible to get recombinant proteins in its enzymatically active form, as well as inducing the production of the polyclonal antibodies in rabbits, and use this to evaluate the expression profile of each one enzyme. The treatment of bananas with the hormone ethylene induced the anticipation of the processes of degradation of starch and synthesis of sugars in relation to the control group. While in the control group the variations of protein and transcription levels for alpha-amylase suggests a reduction in the gene expression, in the ethylene group was not possible to detect the expression of the protein, despite the increments in the transcription and activity. Such fact can be associated with the degradation of the starch granules and the resultant surface protein solubilization, and the probable increase in the protein turnover promoted by ethylene treatment. In response to the ethylene, the peak related to beta-amylase activity has been anticipated and the same was occurred with the transcription and translation of this enzyme. These results suggest that the profile of expression and activity of beta-amylase are directly related to the degradation of starch and do respond to hormonal treatment of banana fruits, which could not be affirmed for the enzyme alpha-amylase