Bovine coronavirus (BCoV): occurrence, molecular diversity and standardization of a PCR to diagnosis using stool samples of calves with and without diarrhea from municipalities of São Paulo and Minas Gerais States, Brazil

O coronavírus bovino (BCoV) é classificado no grupo 2 do gênero Coronavirus da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, causando diarréia em bezerros neonatos, processos respiratórios em bezerros não neonatos e disenteria em vacas adultas. No presente estudo, 203 amostras fecais de bezerros de 19 propriedades leiteiras nos Estados de São Paulo e Minas Gerais foram submetidas à prova de hemaglutinação/ inibição da hemaglutinação (HA/HI) para a detecção de coronavírus e a uma reação de PCR dirigida ao gene codificador da RNA-polimerase RNA-dependente dos coronavírus (PCR pol), sendo feita a comparação entre as duas técnicas através dos testes Kappa e J de Youden. Amostras positivas à PCR pol foram submetidas a uma reação de PCR para amplificação de um segmento de 488 pares de bases correspondentes à região hipervariável do gene codificador da subunidade S1 da proteína S, sendo os fragmentos submetidos a seqüenciamento de DNA para a reconstrução genealógica das amostras estudadas. Ainda, a presença de rotavírus foi pesquisada pela técnica de PAGE. Segundo a técnica de HA/ HI, 35,47% das amostras e 73,68% das propriedades rurais forma positivas para BCoV, enquanto que pela PCR pol 25,12% das amostras e 52,63% das propriedades rurais foram positivas para este vírus. A comparação entre as duas técnicas resultou valores de kappa de -0,048 para os resultados individuais e -0,08 em relação às propriedades rurais e J de Youden de -0,045 para os resultados individuais e -0,1 em relação às propriedades rurais, demonstrando baixa concordância entre as duas provas. A genealogia obtida por máxima parcimônia através de algoritmo heurístico e baseada em seqüências da região hipervariável do gene codificador da subunidade S1 da proteína S de 15 amostras de campo aqui estudadas, da amostra Kakegawa de coronavírus bovino utilizada como controle positivo e de 10 seqüências recuperadas dos GenBank revelou a existência de dois genotipos dentro desta espécie viral, sendo os dois genotipos encontrados entre amostras brasileiras. A identidade média de nucleotídeos entre as 15 amostras brasileiras foi de 98,34%, com similaridade média de aminoácidos de 98%. Amostras pertencentes ao genotipo 2 apresentaram uma deleção de 18 nucleotídeos/ 6 aminoácidos dentro da região correspondente ao domínio II da proteína S. A árvore de máxima parcimônia enraizada tendo bredavírus como grupo externo revelou que esta deleção ocorreu em um único momento na genealogia dos coronavírus bovinos. Rotavírus foi encontrado em 12,6% das amostras fecais individuais e 28, 57% das propriedades rurais pesquisadas. Estes resultados são os primeiros baseados em amostras brasileiras de coronavírus bovino e contribuem para a caracterização molecular do BCoV, para a predição da eficiência de imunógenos e para o encontro de marcadores moleculares úteis para estudos epidemiológicos continuados em relação às diarréias neonatais em bovinos.Bovine coronavirus (BCoV) belongs to group 2 of the genus Coronavirus from the order Nidovirales, family Coronaviridae and causes diarrhea in newborn calves, respiratory diseases in non-newborn calves and dysentery in cows. In the present study, 203 stool samples of calves from 19 dairy farms from São Paulo and Minas Gerais States were submitted to hemagglutination/ hemagglutination inhibition test (HA/HI) to bovine coronavirus detection and a PCR assay targeted to the RNA-polymerase RNA-dependent gene of coronaviruses (PCR pol), the comparison between the two tests carried out with Kappa and Youden´s J tests. Samples positive to PCR pol were submitted to a PCR assay that amplifies a 488 base-pair fragment which corresponds to the hypervariable region of the gene coding for the S1 subunit of the S protein; the amplified fragments were submitted to DNA sequencing aiming the genealogic reconstruction of the studied samples. Rotavirus was surveyed with the PAGE test. The HA/ HI test resulted 35.47% of samples and 73.68% of farms positive to BCoV, while, according to PCR pol, 25.12% of the samples and 52.63% of the farms were positive to this virus. The comparison between the two tests produced a kappa value of -0.048 to individual results and -0.08 to the farms and Youden´s J value of -0.045 to individual results and -0.1 to the farms, showing low agreement between the two tests. Maximum parsimony genealogy with an heuristic algorithm based on sequences of the hypervariable region of the gene coding for the S1 subunit of the S protein from 15 field samples here studied, from the Kakegawa bovine coronavirus strain used as positive control and from 10 sequences retrieved from GenBank showed the existence of two genotypes in this viral species. Mean nucleotide identity between the 15 Brazilian samples was 98.34%, with mean amino acid similarity of 98%. Samples from genotype 2 showed a deletion of 18 nucleotides/ 6 amino acids inside the domain II region of the S protein. Rooted maximum parsimony tree with bredavirus as an outgroup revealed that this deletion has happened only once in bovine coronavirus genealogy. Rotavirus was found in 12.6 % of stool samples and 28.57% of the surveyed farms. These are the first results based on Brazilian strains of bovine coronavirus and contribute to molecular characterization of BCoV, to the prediction of the efficiency of immunogens and to the finding of molecular markers useful to continued epidemiologic surveys on newborn bovine diarrhea