Study of mechanistic bases of neuronal differentiation mediated by Ca2+ activity through purinergic and cholinergic receptors

Muitos subtipos de receptores são ativados pelo mesmo ligante, mas estão acoplados a diferentes mensageiros secundários podendo produzir sinalização divergente em uma célula, enquanto receptores ativados por diferentes ligantes, mas que compartilham o mesmo mensageiro secundário, podem produzir sinalização convergente. Para examinar as bases mecanísticas que influenciam a proliferação e a diferenciação celular determinamos as funções de liberação intracelular de Ca2+ e a excitabilidade celular mediada pelos receptores purinérgicos e colinérgicos utilizando imageamento de cálcio por microscopia confocal. Para tanto, caracterizamos a participação dos subtipos P2X1-7 e P2Y1,2,4,6 de receptores purinérgicos aos níveis dos transcritos de mRNA e de expressão protéica, assim como pela atividade de induzir os transientes de [Ca2+]i, aumento na concentração livre de cálcio intracelular, durante a diferenciação neuronal de células P19 de carcinoma embrionário, que foram utilizadas como modelo in vitro para o desenvolvimento neuronal precoce. Em células embriônicas os receptores P2Y1,2, P2X4 ou os heteromultímeros de P2X com farmacologia semelhante ao do receptor P2X4 foram os responsáveis pelos transientes de [Ca2+]i induzidos pelo ATP e seus análogos. Ao término da diferenciação neuronal, os receptores P2Y2,6 e P2X2 foram os principais mediadores das respostas de [Ca2+]i. Obtivemos evidências do envolvimento destes receptores na indução da proliferação tanto de células embriônicas como de progenitores neuronais, por ensaios de incorporação de BrdU, e da indução da diferenciação neuronal das células progenitoras, na presença de vários agonistas e antagonistas de receptores purinérgicos. Como resultado desses estudos, a regulação da proliferação e diferenciação celular foi principalmente devida aos subtipos de receptores P2Y1 e P2Y2, já que estes efeitos foram eliminados após a depleção dos depósitos intracelulares de cálcio e pela demonstração de que estes eram os possíveis receptores funcionais. Entre os receptores colinérgicos, fornecemos evidências para a expressão de receptores nicotínicos (nAChRs) e muscarínicos (mAChRs) funcionais durante a diferenciação de células P19. Detectamos a expressão e a atividade dos subtipos de nAChRs formados pelos subtipos α2-α7, β2, β4 e M1-M3 e M5 de mAChRs durante a diferenciação neuronal. As respostas de [Ca2+]i induzidas pelos agonistas dos nAChRs foram observadas em células P19 embriônicas e neuronais. As respostas de [Ca2+]i mediadas pelos receptores muscarínicos, em níveis próximos aos basais em células embriônicas, aumentaram durante a diferenciação. As elevações na [Ca2+]i induzidas pelos nAChRs em células indiferenciadas foram devidas ao influxo de Ca2+ do meio extracelular. Em células diferenciadas em neurônios, os aumentos de transientes de [Ca2+]i induzidos pelos nAChRs foram parcialmente inibidas após o pré-tratamento das células com a rianodina, enquanto as respostas de [Ca2+]i mediadas pelos mAChR não foram afetadas na presença deste composto, sugerindo uma contribuição da liberação de Ca2+ a partir dos depósitos de Ca2+ sensíveis à rianodina para as elevações mediadas pelos nAChRs. Demonstramos também, que a nicotina, agindo através dos nAChRs, inibiu a proliferação em células embriônicas, porém, a induziu em células progenitoras neuronais pela mobilização de Ca2+ dos depósitos intracelulares. A muscarina induziu em células embriônicas o aumento na proliferação via mAChRs acoplados às proteínas Gαq/11, e promoveu a diferenciação neuronal via M2 mAChRs em células precursoras neuronais. Estes dados sugeriram que a acetilcolina agindo via mAChR funciona como um mitógeno que ativa as proteínas quinases de trifosfato de inositol (IP3) e que poderia estar envolvida na síntese de DNA durante os estágios iniciais da neurogênese. Nós ainda provemos evidências que as oscilações de [Ca2+]i são características para cada estágio da diferenciação e são iniciadas pela liberação de Ca2+ mediada pelo IP3. As análises da determinação do fenótipo neuronal na presença de vários inibidores da transdução do sinal induzido pelo cálcio residem na liberação de Ca2+ induzida pelo IP3 é necessária para o progresso da diferenciação neuronal. Assim, os sinais espontâneos de [Ca2+]i são propriedades intrínsecas das células em diferenciação. A modulação de sua freqüência e amplitudes especifica a aquisição de um fenótipo de célula neuronal.Various receptors subtypes are activated by the same ligand although coupled to different second messengers. These receptors act either by inducing divergent signaling in one cell, whereas in another cell different receptors may stimulate the very same pathways producing convergent signaling. We have characterized intracellular Ca2+- release and -influx mediated by purinergic and cholinergic receptors using calcium imaging by confocal microscopy to evaluate the mechanistic bases which influence cell proliferation and differentiation We have characterized the participation of purinergic subtypes P2X1-7 and P2Y1,2,4,6 receptor subtypes at mRNA transcription and protein expression levels as well as receptor-induced changes in free intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) during differentiation of P19 embryonal carcinoma cells as an in vitro model for early neuronal development. The participation of individual P2X and P2Y receptor subtypes in the differentiation process was studied by employing different available purinergic receptor agonists and antagonists. In embryonic cells, P2Y1,2, P2X4 receptors, or P2X-heteromultimers with similar P2X4 pharmacology were responsible for ATP and ATP-analog-induced [Ca2+]i transients. Following completion of neuronal differentiation, P2Y2,6 receptors and P2X2 subtypes were the major mediators of the [Ca2+]i-response. Regulation of cell proliferation and differentiation of P19 embryonic and progenitor cells was mostly due to P2Y1 and P2Y2 receptor activation, as these effects were abolished following depletion of intracellular calcium stores, and they are probably the unique functional P2Y receptors at these stages of differentiation. We also provide evidence for expression of functional nicotinic (nAChRs) and muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) during neuronal differentiation of P19 cells. We have detected expression and activity of nAChRs formed by the subunits α2-α7, β2, β4, and M1-M3 and M5 mAChR subtypes along the differentiation process. Receptor response in terms of nicotinic agonist-evoked Ca2+ flux was observed in embryonic and neuronal-differentiated cells. However, mAChRs-induced calcium responses, merely present in undifferentiated P19 cells, increased during neuronal differentiation. The nAChR-induced [Ca2+]i response in undifferentiated cells was due to Ca2+ influx. However, in differentiated P19 neurons the nAChR-induced [Ca2+]i response was partially inhibited following pretreatment of the cells with ryanodine, while the mAChR-induced response remained unaffected, suggesting the contribution of Ca2+ release from ryanodine-sensitive stores to nAChR- but not mAChR-mediated Ca2+ responses. The presence of functional nAChRs in embryonic cells suggests that these receptors are involved in triggering Ca2+ waves during initial neuronal differentiation. In the present study we have also shown that nicotine, acting via nAChRs, inhibited proliferation in embryonic cells, but induced cell division of progenitor cells by Ca2+ mobilization from internal stores. Stimulation of progenitor cells by muscarine led to an increase in DNA synthesis mainly resulting from activation of Gαq/11-coupled mAChRs. Muscarine as well promoted differentiation of neural precursor cells by activation of M2 mAChRs subtypes. These data suggest that acetylcholine, acting via mAChRs, functions as a mitogen during early neurogenesis. We also provide evidence that oscillations of [Ca2+]i as characteristics for the respective stage of differentiation are initiated by triphosphate inositol (IP3)-mediated Ca2+-release. Neuronal cell fate determination analysis in the presence of various inhibitors of calcium-induced signal transduction underlined that IP3-mediated Ca2+-release is necessary for neuronal differentiation progress. Thus, spontaneous Ca2+-signals are an intrinsic property of differentiating neural precursor cells. Modulation of their frequency and amplitude is believed to direct the acquisition of a defined neuronal phenotype