Control of mitochondrial DNA copy number in bovine cells: a model based on depletion

As mitocôndrias são organelas semiautonômicas, portadoras do próprio DNA, o mtDNA e responsáveis pela produção de energia celular na forma de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa. Atualmente, diferentes tipos de doenças, como distrofias musculares e diversos tipos de câncer, estão associadas à alteração nas moléculas de mtDNA. Na década de 70 um modelo a partir do cultivo celular com brometo de etídio (EtBr) foi desenvolvido com o objetivo de se criar uma linhagem celular depletada de cópias de mtDNA. Desde então os mais variados estudos foram realizados e diversos tipos celulares foram submetidos à depleção do mtDNA. Este projeto teve como objetivos criar um modelo de cultivo celular somático na espécie bovina com depleção de cópias de mtDNA para investigar a resposta da célula a esta condição; avaliar como as células depletadas se comportam na ausência de EtBr, além da utilização destas células no processo de reprogramação celular por indução gênica na tentativa de avaliar o efeito do numero de cópias de mtDNA na indução na espécie bovina. Para tanto foram desenvolvidos três experimentos; Experimento 1- Depleção de mtDNA a partir da utilização do brometo de etídeo; Experimento 2 Repleção do mtDNA; e Experimento 3 Utilização de células bovinas depletadas no sistema de reprogramação nuclear. Todos os experimentos foram avaliados quanto a quantidade de cópias de mtDNA e expressão gênica para os genes Bax, Bcl2 e Tfam. Ademais, os experimentos 1 e 2 foram avaliados quanto a viabilidade celular e apenas o experimento 1 foi avaliado quanto ao crescimento e morfologia celular. O experimento 1 foi avaliado durante o cultivo celular nos períodos D0, D4, D7, D10 e D13, com os grupos experimentais controle (EtBr-C) e tratado com 100 ng/mL de brometo de etídio (EtBr-T), quanto a núero de cópias do mtDNA, o grupo EtBr-T diferiu do grupo EtBr-C (P=0,0459), apresentando menor número de cópias de mtDNA; menor taxa crescimento celular (P<0,05), porém sem alteração na morfologia celular, e na expressão dos genes descritos acima. No experimento da repleção, não houve diferença no número de cópias de mtDNA, entre os grupos EtBr-T e EtBr-R, indicativo de que as células atingiram o estado rho 0 ou que necessitam de mais tempo para ativar a replicação do mtDNA; quanto a viabilidade celular, houve diferença entres os grupos, quanto a expressão gênica, com aumento do Bax e do Bcl-2 para o grupo EtBr-T; O grupo EtBr-R apresentou queda do Bcl-2; para o Tfam houve aumento para o grupo EtBr-T e uma queda para o grupo EtBr-R. Quanto ao experimento 3, não foi possível observar sinais de pluripotência, porém foi detectada uma queda na quantidade de mtDNA dos dois grupos tratados por EtBr (EtBr com e sem Stemcca) e o grupo controle com Stemcca. Para analise de expressão gênica, não houve diferenças entre os grupos em relação ao Tfam. Quanto ao Bax, os grupos controle com Stemcca, controle sem Stemcca e EtBr sem Stemcca não diferiram, e o ultimo também não apresentou diferença quando comparado ao grupo EtBr com Stemcca. Para o Bcl-2, os grupos controle sem Stemcca e EtBr com Stemcca não apresentaram diferenças entre si; o grupo controle sem Stemcca não apresentou diferença quando comparado aos grupos controle com Stemcca e EtBr sem Stemcca. Concluindo, este trabalho no nosso conhecimento, descreve pela primeira vez a produção de células bovinas Rho 0 e discute sobre a relação da função mitocondrial e o processo de reprogramação celular.Mitochondria are semi autonomic organelles which present their own DNA (mtDNA); are in charge of cell energy production as ATP through oxidative phosphorylation. Currently, different types of diseases like muscular distrofy; different types of cancer are associated to alterations of mtDNA molecules. In the 70\'s a model based on cell culture with ethidium bromide (EtBr) was developed in order to create a cell line depleted of mtDNA. Since then, a variety of studies were realized; diverse cell types were submited to mtDNA depletion. This project had as objective creating a model of somatic cell culture in bovine species with depletion of mtDNA copies, in order to investigate cell response to this condition; to analyze depleted cell behavior in the absence of EtBr, besides using this depleteded cell in a reprogramming cell process by genic induction in order evaluate the effect of the number of mtDNA copies during induction in bovine species. Therefore three experiments were developed: Experiment-1 Depletion of mtDNA using ethidium bromide. Experiment-2 repletion of mtDNA; Experiment-3 usage of depleted bovine cells in reprogramming nuclear system. Cell experiments were analyzed according to the quantity of mtDNA copies; genic expression for Bax, BCl2; Tfam genes. Also, experiments 1; 2 were analyzed on cell viability; only experiment 1 was analyzed regarding cell morphology; growth. Experiment-1 was analyzed during cell culture on periods D0, D4, D7, D10, D13, with control experimental groups (EtBr-C),; treated with 100 ng/mL ethidium bromide (EtBr-T); relating to mtDNA quantification the EtBr-T group differed from EtBr-C (P=0,0459) presenting a smaller number of mtDNA copies; smaller growth rate (P