Cellulosic ethanol production by Spathaspora passalidarum from sugarcane bagasse: strategy to improve the fermentability and study of metabolic profiling during fermentation of hemicellulosic hydrolysate

O presente trabalho teve como objetivo principal alcançar progressos científicos no processo de produção de etanol celulósico a partir do bagaço de cana-de-açúcar, utilizando a estratégia de desacetilação alcalina para melhorar a fermentabilidade do hidrolisado hemicelulósico e a metabolômica como ferramenta para avaliar a influência dos inibidores durante conversão dos açúcares a etanol por Spathaspora passalidarum. Além disso, foi também objetivo dessa tese avaliar as alterações químicas e morfológicas em bagaço e palha de cana-de-açúcar durante etapa de otimização das condições alcalinas. As etapas de desacetilação (NaOH) do bagaço e da palha de cana-de-açúcar foram executadas em escala laboratorial com delineamento experimental 23, variando as concentrações de NaOH (0,1; 0,4 e 0,7 %), temperatura (55, 70 e 85 °C) e tempo (1, 3 e 5 h), sendo avaliado rendimento, composição química e parâmetros nanoestruturais na biomassa. Posteriormente, a condição otimizada de desacetilação (0,4 % m/v NaOH, 70 °C, 3 h), apenas do bagaço, foi executada em escala piloto no LNBR e em seguida pré-tratado em ácido diluído (0,5 % v/v H2SO4, 140 °C, 15 min) para obtenção do hidrolisado hemicelulósico. Seguidamente, foram realizadas as fermentações dos hidrolisados hemicelulósicos em biorreator com S. passalidarum e avaliação da influência dos inibidores durante conversão dos acúcares a etanol com metabolômica. Quanto aos resultados em escala laboratorial, o tratamento alcalino removeu 90 % dos grupos acetilas e entre 20-30 % da lignina do bagaço e da palha, enquanto que a remoção de 20 % de xilana e de glucana é observada apenas na palha, mas não no bagaço. Considerando as alterações em nanoescala, nem a cocristalização da celulose, nem a formação de agregados de lignina são observados após os tratamentos alcalinos. Além disso, a termoporometria calorimétrica, bem como as microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão, mostraram uma notável abertura dos poros em nanoescala e o afrouxamento das estruturas da parede celular e consequentemente dos tecidos. A etapa de desacetilação alcalina do bagaço de cana antes do pré-tratamento em ácido diluído resultou no aumento de 12 vezes na produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico (1,3-18,0 g.L-1) e melhora de 16 % na digestibilidade enzimática da glucana. Além disso, análises com metabolômica em S. passalidarum durante 12 horas de fermentação de hidrolisado hemicelulóliso relataram drásticas mudanças no metabolismo dos aminoácidos e das purinas, redução de fluxo na via das pentoses, glicólise e menores níveis de intermediários do ciclo de krebs, como resposta celular aos múltiplos inibidores. Ademais, os inibidores promoveram uma resposta global no metabolismo, afetando a homeostase energética e balanço redox, traduzidos nos menores níveis de ATP e NADPH. Em última análise, essa tese contribuiu com conhecimento sobre o contraste em nível químico e morfológico entre palha e bagaço de cana, obtenção de hidrolisado fermentescível sem necessidade de etapa clássica de detoxificação e com glucana mais digerível; assim como, a compreensão geral da influência dos inibidores durante produção de etanol por S. passalidarum.The general objective of this work was to achieve scientific advances in process of cellulosic ethanol production from sugarcane bagasse using the alkaline deacetylation strategy to improve the fermentability of hemicellulosic hydrolysate and the metabolomics as a tool to evaluate the influence of the inhibitors during conversion of sugars to ethanol by Spathaspora passalidarum. Furthermore, was also evaluated the chemical and morphological alterations in sugarcane bagasse and straw submitted to alkaline treatments. Initially, alkaline solutions for deacetylation (0.4 % w/v NaOH, 70 °C, 3 h) as well as proximal conditions (0.1-0.7 % NaOH, 55-85 °C, 1-5 h) chosen by 23 experimental design were evaluated. Subsequently, the optimized deacetylation condition (0.4 % w/v NaOH, 70 °C, 3 h), only for bagasse, was performed on a pilot plant scale up in LNBR and then pretreated in dilute acid (0.5 % v/v H2SO4, 140 °C, 15 min) to obtain the hemicellulosic hydrolysate. Next, the fermentations of hemicelullosic hydrolysates in bioreactor by S. passalidarum and influence of the inhibitors during conversion of the sugars to ethanol with metabolomic analysis were evaluated. Regarding laboratory scale results, the deacetylation treatment removes ~90 % of the acetyl groups and 20-30 % of the lignin from both bagasse and straw, while removal of ~20 % of the xylan and glucan is observed in straw, but not in bagasse. Considering nanoscale structural alterations, neither cellulose cocrystallization nor formation of lignin aggregates are observed after the alkaline conditions. Furthermore, calorimetric thermoporometry as well as scanning and transmission electron microscopies show substantial introduction of nanoscale porosity and loosening of the tissue and cell wall structures. Alkaline deacetylation step in sugarcane bagasse prior to pretreatment in dilute acid resulted in a 12-fold increase in ethanol production from hemicellulosic hydrolysate (1.3-18.0 g.L-1) as well as 16 % in enzymatic digestibility of glucan. Moreover, metabolomic analysis in S. passalidarum during 12 hours of fermentation in hemicelullosic hydrolysate showed drastic changes in amino acid and purine metabolism, low flux in pentose phosphate and glycolysis pathways as well as a reduced in TCA cycle intermediates as a cellular response to the multiple inhibitors. In addition, the inhibitors promoted a global response in metabolism, affecting energy homeostasis and redox balance, translated into the lower levels ATP and NADPH. Ultimately, this thesis contributed knowledge on chemical and morphological contrast between sugarcane straw and bagasse, obtaining a fermentable hydrolysate without need for a classical detoxification step and with a digestible glucan fraction as well as a general understanding on the influence of the inhibitors during bioethanol production by S. passalidarum