Spectroscopic studies of extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp)

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3.600 kDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta proteína apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho, foi realizado o estudo da estabilidade da oxi-HbGp frente aos processos de dissociação oligomérica e desnaturação, utilizando duas classes de desnaturantes, ou seja, o surfactante brometo de dodeciltrimetilamônio (DTAB), e os agentes caotrópicos cloridrato de guanidina (GuHCl) e ureia. Convém mencionar ainda, que este estudo foi desenvolvido através do uso de duas sondas fluorescentes, 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS) e fluoresceína isotiocianato (FITC), usando as técnicas de absorção óptica, fluorescência estática, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e fluorescência resolvida no tempo. Os resultados de fluorescência estática mostram que o DTAB induz um aumento na intensidade de emissão de fluorescência da sonda ANS, com o deslocamento do máximo de emissão para o azul de 517 para 493 nm. Duas transições são observadas, em 2,5 e 9,5 mmol/L de DTAB, e estão associadas à interação da sonda ANS com agregados pré-micelares e micelas, respectivamente. Na oxi-HbGp, ANS liga a sítios menos expostos ao solvente, quando comparado às micelas de DTAB, caracterizados pela emissão em 467-472 nm. A adição de DTAB ao sistema oxi-HbGp-ANS, no pH 7,0, induz a agregação da proteína, a dissociação oligomérica e desenovelamento da oxi-HbGp. No pH 5,0, a formação de agregados não foi observada. Além disso, o processo de desenovelamento induzido pelo DTAB apresenta duas transições, a primeira em virtude da dissociação oligomérica, e a segunda, provavelmente, devido à desnaturação das subunidades dissociadas. Por outro lado, GuHCl e ureia com concentrações acima de 1,5 e 4,0 mol/L respectivamente, induzem a desnaturação completa da oxi-HbGp, com redução dos grupos hidrofóbicos na superfície da proteína, e o deslocamento do ANS para o meio aquoso, detectado pela redução de intensidade de fluorescência. A técnica de fluorescência resolvida no tempo permitiu avaliar os valores dos tempos de vida para a sonda 1,8-ANS, bem como, para oxi-HbGp. Por último, a oxi-HbGp foi marcada com a sonda covalente fluoresceína isotiocianato (FITC) em dois valores de pH 7,0 e 9,0, e nas proporções sonda:heme de 1:5 e 2:1. A quantidade de FITC efetivamente ligada a oxi-HbGp por heme foi estimada a partir dos dados de absorção óptica. Supondo que o rendimento quântico de FITC no tampão é 100%, os rendimentos quânticos de FITC ligada a oxi-HbGp também foram encontrados. Além disso, estudos preliminares de dissociação e desnaturação da oxi-HbGp marcada com FITC, na presença do surfactante DTAB, foram realizados.Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3,600 kDa, a high oligomeric stability, resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this study, the oxy-HbGp stability, as well as, the oligomeric dissociation and unfolding processes were studied, using two types of denaturants,the surfactant Dodecyl-trimethylammonium bromide (DTAB), and chaotropic agents guanidine hydrochloride (GuHCl) and urea. Moreover, this study was developed based on 8-anilino-1-naphtalene-sulfonic acid (ANS) and fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence probes, using the techniques of optical absorption, static fluorescence, dynamic light scattering (DLS) and time resolved fluorescence. The results of static fluorescence show that dodecyl-trimethylammonium bromide (DTAB) induces an increase in ANS fluorescence emission intensity, with maximum emission wavelength blue-shifted from 517 to 493 nm. Two transitions are noticed, at 2.50 and 9.50 mmol/L of DTAB, assigned to ANS interaction with pre-micellar aggregates and micelles, respectively. In oxy-HbGp, ANS binds to protein sites less exposed to solvent, as compared to DTAB micelles, characterized by emission at 467 - 472 nm. At pH 7.0, the addition of DTAB to the oxy-HbGp-ANS system induced the protein aggregation, oligomeric dissociation and unfolding of oxy-HbGp. At pH 5.0, no formation of aggregates was observed. Moreover, DTAB-induced unfolding process displays two transitions, one due to oligomeric dissociation and the second one, probably, due to the denaturation of dissociated subunits. On the other hand, guanidine hydrochloride (GuHCl) and urea, at concentrations above 1.5 and 4.0 mol/L, respectively, induce the full HbGp denaturation, with reduction of ANS-bound oxy-HbGp hydrophobic patches on the surface of the proteins. The shift of ANS to the aqueous medium was detected by the reduction in the fluorescence intensity. Time resolved fluorescence technique allowed to evaluate the lifetimes of ANS, as well as, for oxy-HbGp. Finally, oxy-HbGp was labeled with covalent probe fluorescein isothiocyanate (FITC), at pH values 7.0 and 9.0, and at probe: heme ratios of 1:5 and 2:1. The quantity of FITC effectively bound to oxy-HbGp, on the heme basis was estimated from the optical absorption data. Assuming a 100% quantum yield for FITC in buffer, the quantum yield of FITC bound to oxy-HpGp was also estimated. In addition, preliminary studies of dissociation and denaturation of oxy-HbGp labeled with FITC, in the presence of DTAB surfactant, were accomplished