Mixed culture, chemical and genetic manipulation of microorganisms:strategies for diversifying the secondary metabolism.

Recentes estudos genômicos têm mostrado que vários fungos e bactérias possuem um potencial biossintético superior à quantidade de me tabólitos secundários já isolados desses micro-organismos. A descoberta de produtos naturais inéditos e bioativos é limitada pela impossibilidade dos micro-organismos expressarem to das as suas rotas biossintéticas em laboratório. Assim, estratégias alternativas para i nduzir a produção de produtos naturais microbianos são necessárias. A utilização de cultur as mistas de micro-organismos é uma estratégia que vem sendo recentemente utilizada, na tentativa de mimetizar condições mais naturais de crescimento. Além disso, a adição de mo duladores químicos e epigenéticos às culturas microbianas também pode potencialmente est imular a produção de compostos de interesse, seja por ativar mecanismos celulares em resposta à condição de estresse, ou por alterar a taxa de transcrição de certos genes, em f unção de mudanças no grau de enovelamento da cromatina. Alternativamente, a indu ção de certos genes, e até mesmo a diversificação do metabolismo secundário, podem ser conseguidos através de engenharia genética, pela manipulação direta de genes de inter esse. A linhagem endofítica Alternaria tenuissima SS77, selecionada para os experimentos de modulaçã o química e epigenética, teve seu metabolismo secundário alterado após o tra tamento com diferentes moduladores. Provavelmente, o efeito observado ocorreu em função de uma eliciação inespecífica dos diferentes moduladores. Além disso, o cultivo misto desse fungo com o fungo endofítico Nigrospora sphaerica SS67 , isolada da mesma planta hospedeira ( Smallanthus sonchifolius ), levou ao isolamento de dois novos policetídeos, da classe das perilenequinonas, juntamente com um já relatado na literatura científica. Para r ealizar os cultivos microbianos mistos, envolvendo uma linhagem bacteriana e uma fúngica, t rês linhagens de actinobactérias e cinco de fungos, todos endofíticos da planta Lychnophora ericoides , foram selecionadas. Alterações no perfil metabólico da cultura mista de Phomopsis sp FLe6 com Streptomyces albospinus RLe7 foram as mais evidentes e por isso a maioria das investigações foram focadas nessa cultura mista. Várias condições de cu ltivo foram testadas e diferentes resultados foram obtidos. Em alguns casos, o desenv olvimento da linhagem fúngica foi inibido pela bacteriana, e em outros, foi observado o inverso. Da mesma forma, houve acentuada inibição da produção de alguns metabólito s secundários na presença da linhagem desafiadora, mas também foi verificada a eliciação de outros. Os extratos das culturas simples desses micro-organismos também apresentaram relativas alterações nos perfis metabólicos em função das condições de cultivo. Os metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp FLe6 e pela actinobactéria Streptomyces albospinus RLe7 foram isolados e caracterizados. Os resultados mostram que as intera ções entre os micro-organismos endofíticos são bastante complexas, estando sujeita s a ação de diversos fatores externos que muitas vezes não podem ser pré-determinados. Po r isso, estabelecer um cultivo misto adequado, do ponto de vista da eliciação da produçã o de metabólitos secundários, pode requerer uma série de tentativas. Ainda assim, os r esultados almejados podem ser conseguidos utilizando essa estratégia. Diferenteme nte das linhagens endofíticas, manipuladas quimicamente através de diferentes estr atégias, a linhagem sequenciada de Fusarium heterosporum ATCC 74349, foi manipulada geneticamente para a co nstrução de um gene biossintético híbrido pks-nrps , contendo a porção nrps do gene híbrido da equisetina e um pks críptico de Aspergillus fumigatus . Era esperado que a linhagem hibridizada fosse capaz de produzir o metabólito se cundário geneticamente planejado, entretanto, após seu cultivo, esse produto não foi detectado nos extratos, e as possíveis razões são discutidas. Ainda que os resultados espe rados não tenham sido obtidos, estudos que contribuam para a ampliação do entendimento das megassintases fúngicas são de extrema valia.Recently, genetic studies have shown that several b acteria and fungi hold a greater biosynthetic potential than the amount of secondary metabolites isolated from these microorganisms. The discovery of novel bioactive na tural products is limited by the inability of microorganisms to express all their biosynthetic pa thways in laboratory conditions. Therefore, alternative strategies to induce the production of microbial natural products are required. Mixed cultures of microorganisms are a strategy tha t has been used to mimic more natural conditions of growth. Furthermore, the addition of chemical and epigenetic modulators to the microbial cultures can also stimulate the productio n of compounds by activating cellular mechanisms in response to stress conditions or by c hanging the transcription rate of certain genes, due to changes in the chromatin folding. Alt ernatively, the induction of some genes, and even the diversification of secondary metabolis m, can be achieved by genetic engineering, by manipulating genes of interest. The endophytic strain Alternaria tenuissima SS77, which was selected for the experiments of che mical and epigenetic modulation, had changed its secondary metabolism after treatment wi th different modulators. Probably, the observed effect was due to a nonspecific elicitatio n of those modulators. Moreover, the mixed cultures of this fungus with the endophytic fungus Nigrospora sphaerica SS67, isolated from the same host plant ( Smallanthus sonchifolius ), led to the isolation of two new polyketides, belonging to perylene quinone class, along with ano ther one already reported in the scientific literature. Three strains of actinobacteria and fiv e fungi, all endophytes of Lychnophora ericoides , were selected to grow in microbial mixed cultures comprising one bacteria and one fungus. Changes in the metabolic profile of the mix ed culture of Phomopsis sp. FLe6 with Streptomyces albospinus RLe7 were the most obvious, and then further studi es were focused on this mixed culture. Many culture conditions were analyzed and different results were obtained. In some cases, the development of the fun gal strain was inhibited by bacteria, and in other cases was observed the opposite. Similarly , there was a remarkable inhibition of the production of certain secondary metabolites in the presence of the challenging strain, but the eliciting of others was also observed. The extracts of the single cultures of these microorganisms also showed changes in metabolic pro files due to culture conditions. The metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. FLe6 and the actinobacteria S. albospinus RLe7 were isolated and characterized. The results show that interactions between endophytic microorganisms are quite complex and are influenced by various external factors that often can not be previously determined. Theref ore, establishing a suitable mixed culture to elicit the production of secondary metabolites m ay require some attempts. Still, the expected results can be achieved using this strateg y. Unlike the endophytic strains, that was chemically manipulated by different strategies, the sequenced strain Fusarium heterosporum ATCC 74349 was genetically manipulated to construct a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene containing the NRPS portion of the hybrid gene of e quisetin and a cryptic PKS gene of Aspergillus fumigatus . It was expected that hybridized strain could be a ble to produce the secondary metabolite genetically planned, however, after its cultivation, this product was not detected in any extracts, and some possible reasons are discussed. Although the expected results have not been obtained, studies that contri bute to increasing the understanding of fungal megasynthases are extremely valuabl