Structural and functional characterization of two Nucleoside Phosphorylase from Schistosoma mansoni.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. Causada pelo parasita Schistosoma mansoni a esquistossomose mansônica afeta aproximadamente 259 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. O S. mansoni não possui a via \"de novo\" para a biossíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessas bases, portanto, essa via é um alvo em potencial. Agentes capazes de bloquear a atividade das enzimas participantes desta via atuam de forma inespecífica e são quase sempre tóxicos ao homem e por isso o estudo minucioso das pequenas diferenças encontradas entre as enzimas do hospedeiro e do parasita são de extrema importância. Uma diferença marcante entre a via de salvação de purinas do parasita e do hospedeiro humano é a presença de atividade para adenosina fosforilase, que no parasita é exercida por duas entidades distintas: pela enzima Metiltioadenosina fosforilase de S. mansoni (SmMTAP) e por uma enzima até então desconhecida. A enzima SmMTAP naturalmente converte 5\'-deoxi-5\'-metiltioadenosina (MTA) em adenina livre, mas ao contrário do que é visto no hospedeiro, no parasita essa enzima atua preferencialmente na conversão de adenosina. Substituições encontradas no sítio ativo dessa enzima, podem explicar tamanha preferência pelo substrato alternativo, revelando mecanismos distintos da enzima humana. A enzima Purina nucleosídeo fosforilase de S. mansoni (SmPNP) converte inosina e guanosina à hipoxantina e guanina, respectivamente, mas não possui atividade catalítica para adenosina. No entanto, no genoma de S. mansoni é descrita uma isoforma para a SmPNP (SmPNP2), cuja atividade catalítica é desconhecida e, portanto, essa enzima pode também atuar na conversão de adenosina juntamente com a SmMTAP. Assim, os objetivos deste trabalho foram realizar estudos bioquímicos da ação da enzima SmMTAP e realizar a caracterização estrutural e funcional da enzima SmPNP2. Para isso, foram realizadas mutações no sítio ativo da SmMTAP (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L), as mutantes da SmMTAP juntamente com a enzima SmPNP2 foram clonadas, expressas de forma heteróloga e purificadas. Foram realizados ensaios de cristalização e cinéticos por espectrofotometria utilizando um sistema acoplado. A atividade da SmPNP2 foi ainda avaliada por calorimetria e HPLC. Foram determinadas as constantes catalíticas da forma nativa e para os cinco mutantes da SmMTAP para cinco diferentes substratos. Foi determinada atividade catalítica da SmPNP2 por 3 diferentes substratos: adenosina, inosina e citidina, as constantes catalíticas foram determinadas para os três substratos. Foram obtidos cristais para os mutantes da SmMTAP e da SmPNP2, que foram submetidos à difração de raios X nas linhas I04-1 e I02 do laboratório de radiação síncrotron Diamond Light Source (DLS). Foram resolvidas 9 estruturas dos mutantes da SmMTAP e 4 da proteína SmPNP2. Os dados cinéticos, juntamente com os dados estruturais, permitiram compreender mecanismos catalíticos e de interação das proteínas estudadas, complementando o conhecimento do metabolismo do parasita Schistosoma mansoni e revelando alvos em potencial para o desenvolvimento de fármacos específicos.The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. The schistosomiasis is caused by Schistosoma mansoni parasite and affects approximately 259 million people worldwide with 6 million only in Brazil. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the \"de novo\" pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathway for its purine requirement, therefore this pathway is a potential target. Compounds able to block the enzymes from this pathway, are not specific and are often toxic to humans, thus the thorough study about the particularity found between enzymes from host and parasite are extremely important. A notable difference between human and parasite metabolism, is the activity existence to Adenosine phosphorylase that in parasite is carried out by two distinct entities: by Methylthioadenosine phosphorylase (SmMTAP) and by a hitherto unknown enzyme. The SmMTAP enzyme, naturally converts 5\'-deoxy-5\'-methylthioadenosine (MTA) to free adenine and in opposition to host, in the parasite this enzyme acts manly in adenosine conversion. Substitutions found in the active site from SmMTAP, can explain the huge preference by alternative substrate and to expose a distinct mechanisms from human enzyme. The Purine nucleoside Phosphorylase from S. mansoni (SmPNP) converts inosine and guanosine to hypoxanthine and guanine, respectively, but it not possess catalytic activity to adenosine conversion. However in the S. mansoni genome there is a isoform to SmPNP, whose activity is unknown, thus is possible that SmPNP2 enzyme also can to convert adenosine. This study aimed to perform biochemical studies to investigate the SmMTAP enzyme action and perform the structural and functional characterization of SmPNP2. For this propose was made site-directed mutagenesis (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L). The SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme were cloned, expressed by heterolog process and purified. Were perform kinetic assays by spectrophotometric method in a coupled system. The SmPNP2 activity was also available by calorimetry and HPLC methods. Were determined the catalytic constants to wild and mutants SmMTAP to five different substrate. Was determinated to SmPNP2 catalictical activity and kinetics parameters to three substrate: adenosine, inosine e cytidine. Were obtained crystals from SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme, those crystals were submitted to X-rays diffractions in the I04-1 and I02 beamlines from Diamond Light Source (DLS). Nine structures were obtained from SmMTAP mutants and four from SmPNP2 enzyme. The kinetics and structural data allowed understanding the catalytic and interaction mechanisms about the protein studied, supplementing the knowledge around Schistosoma mansoni metabolism and reporting potential targets for the specific drugs development