Characterization of Escherichia coli strains carrying different rpos alleles.

A bactéria Escherichia coli é encontrada em diversos habitats e deve estar preparada para sobreviver e crescer em condições desfavoráveis. A adaptação da bactéria a diferentes condições obriga-a a controlar a expressão de genes de forma eficiente. Uma das formas primárias de controle de expressão gênica é a competição entre os diversos fatores sigma pela ligação ao cerne da RNA polimerase. d70 é o fator sigma mais abundante e participa da transcrição da maioria dos genes de E. coli, enquanto que dS é o segundo em importância e reconhece promotores de genes relacionados à resposta geral ao estresse. O gene rpoS, que codifica para dS é altamente polimórfico, e adquiri mutações frequentemente. A mutação pontual C®T na posição 97 da ORF de rpoS, resulta em um códon de parada TAG (âmbar). Um Shine-Dalgarno alternativo e um códon de início de tradução na posição 157 dá início a uma proteína RpoS truncada, que é parcialmente funcional. Uma das situações de estresse na qual dS é ativado corresponde à privação de fosfato inorgânico. Porém, na limitação deste nutriente ocorre também a ativação do regulon PHO, cujos genes são predominantemente transcritos por d70. Neste trabalho, o efeito da versão truncada de RpoS sobre a expressão de genes dependentes de d70 (lacZ, phoA e pstS) e de genes dependentes de dS (osmY e proU) foi testado. Foram também realizados ensaios de estresse oxidativo, osmótico e pelo frio. O perfil de atividade parcial descrito para RpoSam pôde ser observado em alguns casos, porém em outros o comportamento deste alelo se assemelhou ao do mutante rpoS nulo. Paralelamente, foi testada também uma cepa de E. coli que carrega a mutação âmbar em rpoS, mas esta é suprimida, resultando na expressão de uma proteína RpoS normal. A proteína RpoS truncada não pôde ser visualizada em immunoblots, provavelmente porque esta é traduzida de forma pouco eficiente a partir do Shine-Dalgarno alternativo. Com o objetivo de incrementar a detecção de RpoS em ensaios de imuno-detecção, foi inserida por recombinação alélica uma etiqueta SPA altamente imunogênica na porção C-terminal da proteína.Escherichia coli can be found in many different habitats and has to be prepared to survive and grow under unfavorable conditions. Bacteria adaptation to different growth conditions requires an efficient control of gene expression. One of the primary forms of gene expression control is the competition between different sigma factors for the binding to the core RNA polymerase. d70 is the most abundant sigma factor and participates in the transcription of most E. coli genes. dS is the second one in importance and recognizes promoters of genes related to the general stress response. The rpoS gene, which encodes dS, is highly polymorphic and acquires mutations very often. The transition C®T at position 97 in the rpoS ORF results in a stop codon TAG (amber). Due to the presence of an alternative Shine-Dalgarno and a translation initiation codon at position 157 a truncated RpoS protein that is partially functional is translated. One of the stress situations that dS is activated is the starvation for inorganic phosphate. Phosphate limitation also triggers the activation of the PHO regulon, whose genes are predominantly transcribed by d70. In the present study, the effect of the truncated version of RpoS on the expression of d70 dependent genes (lacZ, phoA e pstS) and dS dependent genes (osmY e proU) was tested. Bacteria were also assayed for sensitivity to oxidative, osmotic and cold stress. The profile of partial activity described for the truncated RpoS could be observed in some cases, while in others the behavior of this allele resembled the rpoS null mutant. In parallel, an E. coli strain which suppresses the amber mutation in RpoS, resulting in the expression of a normal protein was also tested. A band correponding to the truncated RpoS could not be detected in immunoblots probably due to inefficient translation from the alternative Shine-Dalgarno. To improve the detection of RpoS, a highly immunogenic SPA tag was inserted in the C-terminal region of the protein